Открытие стало результатом исследования в Юго-Западном Университете штата Калифорния, в котором метод редактирования генов с одним разрезом использовался на мышах и человеческих клетках для исправления общей мутации, лежащей в основе МДД, смертельного заболевания, вызванного потерей дистрофина, белка, критически важного для мышечной функции.
При тестировании метода ученые обнаружили, что корректировка дозировок компонентов CRISPR для редактирования генов может значительно улучшить выработку дистрофина отредактированными генами.
Далее они обнаружили, что оптимальное соотношение компонентов изменяется в зависимости от того, какая часть ДНК редактируется.
«Поскольку мы тестируем CRISPR на других дефектных частях гена дистрофина, может быть важно настроить наши формулы для получения оптимальных результатов», – сказал д-р. Эрик Олсон, возглавлявший исследование, опубликованное в Science Advances. "Это новое понимание еще больше облегчает использование CRISPR в качестве терапии Дюшенна и, возможно, ряда других заболеваний."
Неожиданная находка
Техника редактирования генов, используемая исследователями, требует двух компонентов – фермента под названием Cas9, который разрезает ДНК, и направляющей РНК, которая функционирует как молекулярное устройство GPS, направляя Cas9 к определенной последовательности ДНК в геноме для редактирования.
Доктор. Лаборатория Олсона разработала метод редактирования дефектной части гена дистрофина путем загрузки Cas9 в аденоассоциированный вирус (AAV), безвредный вирус, который используется для доставки компонентов редактирования в клетки. Направляющая РНК также загружается в AAV, чтобы направить Cas9 к мутации, где он отрезает ДНК.
Процесс редактирования обходит мутацию и позволяет мышечным волокнам вырабатывать дистрофин, с положительными результатами, задокументированными в предыдущих исследованиях Dr. Олсон в клетках крупных млекопитающих, мышей и человека.
В этих исследованиях команда использовала стандартное соотношение Cas9 1: 1 и направляющую РНК, чтобы помочь восстановить выработку дистрофина в мышцах до более чем 90 процентов от нормы.
В новом исследовании, нацеленном на другую часть гена, они обнаружили, что соотношение 1: 1 также не работает: выработка дистрофина восстанавливалась только до 5 процентов от нормы при попадании в кровоток.
Путем проб и ошибок ученые обнаружили, что использование соотношения направляющей РНК к Cas9 10: 1 позволяет оптимально редактировать этот конкретный сегмент гена дистрофина. В течение четырех недель после введения дозы CRISPR продукция дистрофина была восстановлена примерно в 90 процентах мышечных и сердечных волокон у мышей с распространенной мутацией МДД.
«Это удивительно, – сказал доктор. И-Ли Минь, первый автор исследования. «Мы всегда поставляли направляющую РНК и Cas9 с использованием двух вирусов в равных количествах и не думали об изменении соотношения."
Дефектные экзоны
МДД, наиболее распространенное генетическое заболевание со смертельным исходом у мальчиков, приводит к мышечной и сердечной недостаточности и преждевременной смерти к 30 годам.
Пациентов заставляют садиться в инвалидные коляски по мере того, как их мышцы деградируют, и в конечном итоге на респираторы, поскольку их диафрагмальные мышцы ослабевают. Эффективного лечения не существует, хотя ученые десятилетиями знали, что дефект любого из 79 экзонов, составляющих длинный ген дистрофина, вызывает это состояние.
Доктор. Олсон опубликовал несколько исследований, в которых его лаборатория делала отдельные разрезы в стратегических точках ДНК для исправления мутаций. Включая его последнее исследование, посвященное делеции экзона 44, его лаборатория создала методы CRISPR, которые нацелены на пять наиболее распространенных дефектов, наблюдаемых у пациентов с МДД, что составляет около половины случаев во всем мире.
Клиническое лечение экзона 44, расположенного в одной из наиболее распространенных горячих точек мутации гена, может принести пользу примерно 12 процентам пациентов.
Эти методики еще не одобрены для клинического использования, но д-р. Команда Олсона сделала важный шаг к этой цели в прошлом году после публикации научного исследования, показывающего, что редактирование CRISPR экзона 51 остановило прогрессирование МДД у собак.
В течение нескольких недель после редактирования гена недостающий белок был восстановлен в мышечной ткани по всему телу, в том числе на 92% исправлено сердце и 58% – диафрагма, основная мышца, необходимая для дыхания. Ученые подсчитали, что 15-процентный порог необходим, чтобы значительно помочь пациентам.
Лаборатория проводит долгосрочные исследования на собаках, чтобы определить, остается ли уровень дистрофина стабильным, и убедиться, что редактирование генов не вызывает побочных эффектов.
Доктор. Олсон надеется, что следующим шагом за пределами собак станет клиническое испытание, которое будет среди нескольких, которые программа генной терапии UT Southwestern стремится запустить в ближайшие годы для борьбы с многочисленными смертельными детскими заболеваниями.
«Нам нужно сделать еще больше, прежде чем мы сможем использовать это в клинических условиях», – сказал доктор.
Олсон сказал: "Но интересно видеть, как далеко мы продвинулись."
Об исследовании
Доктор. Олсон является директором Центра регенеративной науки и медицины Хамона в Юго-Западном Юго-Западном университете, а также профессором и заведующим кафедрой молекулярной биологии. Он занимает почетную кафедру Pogue по исследованиям врожденных пороков сердца, Институт Роберта А. Заслуженный научный руководитель Уэлча, а также звание профессора Энни и Уилли Нельсон в области исследований стволовых клеток. Он также является основателем Exonics Therapeutics Inc., запущен в феврале 2017 года для продвижения и коммерциализации своих исследований.
Исследование было частично поддержано Exonics Therapeutics Inc. и гранты от Национального института здоровья, сенатор Пол Д. Центр совместных исследований мышечной дистрофии Wellstone, The Robert A. Фонд Уэлча, Родительский проект по мышечной дистрофии и CureDuchenne.
Заявления о раскрытии информации: Dr.
Эрик Олсон – научный соучредитель и консультант Exonics Therapeutics, имеет лицензию и инвестиционные интересы в компании. Доктора.
Олсон и И-Ли Мин являются соавторами заявки на патент, касающейся модели мыши и стратегии, представленной в этом исследовании. Доктор. Мин работал в Dr.
Лаборатория Олсона, пока проводились исследования, и сейчас является сотрудником Exonics.