За счет химической подстройки концов вставляемой ДНК новый метод до пяти раз более эффективен, чем существующие подходы. Исследователи увидели улучшения в различных генетических местоположениях, протестированных в линии клеток почек человека, даже увидев 65% встраивания в одном месте, где предыдущий максимум был 15%.
Под руководством профессора химической и биомолекулярной инженерии Хуэйминь Чжао исследователи опубликовали свою работу в журнале Nature Chemical Biology.
Исследователи обнаружили, что CRISPR является эффективным инструментом для отключения или «нокаутации» гена.
Однако в человеческих клетках это был не очень эффективный способ вставки или «вколачивания» гена.
«Хороший метод подстановки важен как для применения в генной терапии, так и для фундаментальных биологических исследований с целью изучения функции генов», – сказал Чжао, руководитель темы дизайна биосистем в Carl R. Институт геномной биологии Везе в Иллинойсе. «С помощью метода нокаута мы можем добавить метку к любому гену, изучить его функцию и увидеть, как на экспрессию гена влияет рак или изменения в структуре хромосом. Или для применения в генной терапии, если у кого-то есть заболевание, вызванное отсутствующим геном, мы хотим иметь возможность вставить его."
В поисках способа повышения эффективности группа Чжао рассмотрела 13 различных способов модификации вставленной ДНК.
Они обнаружили, что небольшие изменения в самом конце ДНК увеличивают как скорость, так и эффективность вставки.
Затем исследователи протестировали вставку фрагментов ДНК с модифицированными концами различного размера в нескольких точках генома, используя CRISPR-Cas9 для точного нацеливания на определенные сайты для вставки. Они обнаружили, что эффективность улучшилась в два-пять раз, даже при вставке более крупных фрагментов ДНК – вставка, которую сделать сложнее всего.
«Мы предполагаем, что эффективность улучшилась настолько, что химическая модификация до конца стабилизирует ДНК, которую мы вставляем», – сказал Чжао. "Обычно, когда вы пытаетесь перенести ДНК в клетку, она разрушается ферментами, которые разъедают ее с концов.
Мы думаем, что наша химическая добавка защищает концы. В ядро попадает больше ДНК, и эта ДНК более стабильна, поэтому я думаю, что у нее больше шансов интегрироваться в хромосому."
Группа Чжао уже использует этот метод для маркировки основных генов в исследованиях функций генов.
Они намеренно использовали стандартные химические вещества для модификации фрагментов ДНК, чтобы другие исследовательские группы могли использовать тот же метод для своих собственных генетических исследований.
«В прошлом мы разработали довольно много методов подстановки, но мы никогда не думали об использовании химических веществ для повышения стабильности ДНК, которую мы хотим вставить», – сказал Чжао. "Это простая стратегия, но она работает."