Исследование будет опубликовано 18 февраля в журнале Nature Medicine.
В 2016 году Чарльз Герсбах, доцент кафедры биомедицинской инженерии семьи Руни в Duke, опубликовал одно из первых успешных применений CRISPR для лечения модели генетического заболевания на животных с помощью стратегии, которая может быть применена в терапии человека. С тех пор было опубликовано много дополнительных примеров, и несколько методов лечения с помощью редактирования генома, направленных на человеческие заболевания, в настоящее время проходят клинические испытания, и в процессе их будет еще больше.
Последнее исследование Герсбаха сосредоточено на мышиной модели МДД, которая вызвана неспособностью организма вырабатывать дистрофин, длинную белковую цепь, которая связывает внутреннюю часть мышечного волокна с окружающей его поддерживающей структурой.
Дистрофин кодируется геном, содержащим 79 областей, кодирующих белок, называемых экзонами.
Если один или несколько экзонов разрушены или удалены из-за унаследованной мутации, цепь не выстроится, что приведет к медленному измельчению и разрушению мышц. Большинство пациентов прикованы к инвалидной коляске к 10 годам и не доживают до 20-30 лет.
Герсбах работает над потенциальным генетическим лечением Дюшенна с 2009 года. Его лаборатория была одной из первых, кто начал сосредотачиваться на CRISPR / Cas9, модифицированной версии бактериальной системы защиты, которая нацелена и разрезает ДНК вторгшихся вирусов. Его подход использует CRISPR / Cas9, чтобы вырезать экзоны дистрофина вокруг генетической мутации, оставляя естественную систему репарации ДНК организма, чтобы сшить оставшийся ген вместе, чтобы создать укороченную, но функциональную версию гена дистрофина.
«Поскольку мы продолжаем работать над созданием генетических методов лечения на основе CRISPR, крайне важно проверить наши предположения и тщательно оценить все аспекты этого подхода», – сказал Герсбах. «Целью наших экспериментов было проверить некоторые идеи, обсуждаемые в этой области, которые помогут нам понять потенциал CRISPR для лечения генетических заболеваний в целом и мышечной дистрофии Дюшенна в частности.
Это включает мониторинг долгосрочной устойчивости ответа перед лицом потенциальных иммунных ответов против бактериального белка Cas9."
Первое восьминедельное исследование показало, что функциональный дистрофин восстановился, а мышечная сила увеличилась. Однако он не исследовал долгосрочную устойчивость лечения.
«Широко распространено мнение, что редактирование генов приводит к постоянной коррекции генов», – сказал Герсбах. "Однако важно изучить теоретические возможности, которые могут подорвать эффекты редактирования генов, такие как потеря обработанных клеток или иммунный ответ."
Целью нового исследования было изучить факторы, которые могут изменить долгосрочные эффекты редактирования генов на основе CRISPR / Cas9.
Кристофер Нельсон, научный сотрудник лаборатории Герсбаха, руководивший работой, ввел одну дозу терапии CRISPR внутривенно как взрослым, так и новорожденным мышам, несущим дефектный ген дистрофина. В течение следующего года исследователи измерили, сколько мышечных клеток было успешно отредактировано и какие типы генетических изменений были внесены, а также генерацию любого иммунного ответа против бактериального белка CRISPR, Cas9, который действует как «ножницы».
Это сокращает геном.
В других исследованиях сообщалось, что иммунная система мыши может реагировать на Cas9, что потенциально может помешать эффективности терапии CRISPR. Несколько групп также сообщили, что у некоторых людей уже есть иммунитет к белкам Cas9, вероятно, из-за предыдущего контакта с бактериальным хозяином.
«Хорошая новость заключается в том, что, хотя мы наблюдали как антитела, так и Т-клеточные ответы на Cas9, ни один из них, по-видимому, не привел к какой-либо токсичности у этих мышей», – сказал Нельсон. "Реакция также не помешала терапевтической способности успешно редактировать ген дистрофина и обеспечивать долгосрочную экспрессию белка."
Результаты также предложили подходы к решению потенциальных проблем, если они возникнут в будущем. Например, исследователи заметили, что при внутривенном введении двухдневных мышей без полностью развитой иммунной системы иммунный ответ обнаружен не был. Редактирование генома CRISPR оставалось стабильным, а в некоторых случаях даже улучшалось в течение года.
Можно представить себе доставку терапии младенцам как метод обхода или модуляции нежелательного иммунного ответа.
Однако Герсбах и Нельсон признают, что иммунная система мыши часто функционирует совершенно иначе, чем иммунная система человека. И скрининг новорожденных на МДД в настоящее время широко не проводится; большинство диагнозов Дюшенна ставятся в возрасте от трех до пяти лет. Герсбах сказал, что для решения этой проблемы подавление иммунной системы во время лечения может быть жизнеспособным подходом.
Исследователи также изучают потенциальные стратегии ограничения экспрессии или доставки Cas9 только в мышечные клетки на короткие промежутки времени, что может снизить иммунное обнаружение.
«Нам было приятно наблюдать, что все мыши чувствовали себя хорошо через год после лечения, но наши результаты показывают, что необходимо уделять больше внимания иммунному ответу по мере того, как мы движемся к более крупным моделям животных», – сказал Нельсон.
Нельсон и Герсбах ранее исследовали возможность нецелевого редактирования с помощью CRISPR / Cas9 для непреднамеренного изменения других сайтов в геноме и сообщили о минимальной активности на вероятных нецелевых сайтах. Однако в других недавних исследованиях сообщалось, что CRISPR иногда может вносить генетические изменения в нужное место, но не так, как предполагалось.
Например, некоторые исследования показали, что CRISPR может вырезать генетические участки намного больше, чем предполагалось, или что фрагменты ДНК могут встраиваться в место разреза. Об этих типах правок ранее не сообщалось в исследованиях по редактированию генома, потому что используемые методы выявляли только предполагаемое редактирование.
Чтобы всесторонне сопоставить все изменения, происходящие в гене дистрофина, Нельсон использовал подход секвенирования ДНК, который агностически сообщает о любом типе редактирования.
Удивительно, но в дополнение к предполагаемому удалению экзона-мишени было сделано много типов редактирования, включая высокий уровень вставки последовательностей ДНК из вирусного вектора, кодирующего систему CRISPR / Cas9.
В зависимости от типа ткани и дозировки доставленного CRISPR до половины изменений на мишени приводили к этим альтернативным изменениям последовательности. Хотя этот результат был неожиданным, непреднамеренные изменения последовательности, по-видимому, не влияют на безопасность или эффективность этого подхода к редактированию гена CRISPR / Cas9 для МДД.
«Ни одно из этих изменений не обязательно должно вызывать беспокойство в данном случае, потому что ген дистрофина уже неисправен», – сказал Нельсон. «При этом любые непредвиденные результаты могут потенциально снизить эффективность редактирования генов, которого вы пытаетесь достичь, что подтверждает важность разработки способов объективного выявления и смягчения альтернативных изменений в будущих исследованиях."
«Предыдущие исследования показали, что могут произойти некоторые из этих других типов правок», – сказал Герсбах. "Но это одно из первых всеобъемлющих измерений этих событий на животной модели с использованием терапевтически релевантного подхода. В дальнейшем это явление необходимо тщательно отслеживать и лучше понимать. Методы, позволяющие избежать этих альтернативных изменений и увеличивающие частоту предполагаемого редактирования, будут важны для максимального увеличения потенциала редактирования генома для лечения заболеваний."