С помощью этого нового подхода исследователи надеются значительно расширить инструменты на основе CRISPR, доступные для биомедицинских инженеров, открыв новые и разнообразные границы технологий геномной инженерии.
В исследовании, опубликованном в сентябре. Чарльз Герсбах, доцент кафедры биомедицинской инженерии в Duke, и Адриан Оливер, научный сотрудник лаборатории Герсбаха, возглавлявший проект, описывают, как они успешно использовали системы CRISPR класса 1 для превращения генов-мишеней. включение и выключение и редактирование эпигенома в клетках человека впервые.
CRISPR-Cas – это система защиты, в которой бактерии используют молекулы РНК и ассоциированные с CRISPR (Cas) белки для нацеливания и разрушения ДНК вторгшихся вирусов.
Открытие этого феномена и перепрофилирование молекулярного механизма вызвали революцию в области редактирования генома, поскольку исследователи научились владеть инструментом для целенаправленного нацеливания и редактирования ДНК в клетках человека.
CRISPR-Cas9, наиболее часто используемый сегодня инструмент редактирования генома, относится к системе CRISPR класса 2. Системы класса 2 менее распространены в бактериальном мире, но с ними теоретически проще работать, поскольку они полагаются только на один белок Cas для нацеливания и расщепления ДНК.
Системы класса 1 не так просты, они полагаются на несколько белков, работающих вместе в комплексе под названием Cascade (комплекс, связанный с CRISPR для противовирусной защиты), для нацеливания на ДНК. После связывания Cascade привлекает белок Cas3, который разрезает ДНК.
«Если вы посмотрите на отдельные системы CRISPR для всех бактерий в мире, то почти 90 процентов из них относятся к классу 1», – сказал Герсбах. «Биология CRISPR-Cas – невероятный источник инструментов биотехнологии, но до недавнего времени все смотрели только на небольшой кусок пирога."
Чтобы продемонстрировать возможности системы класса 1, Оливер прикрепил активаторы генов к определенным сайтам по типу I E. coli Cascade и нацелены на систему для связывания промоторов генов, которые регулируют уровни экспрессии генов. Поскольку она не включала белок Cas3 в эксперимент, не было никакого разрезания ДНК и никаких изменений в базовой последовательности ДНК. Эксперимент показал, что активатор Cascade не только связывается с правильным сайтом и может повышать уровни целевого гена, но и делает это с точностью и специфичностью, сопоставимой с CRISPR / Cas9.
Оливер повторил процесс, используя каскадные комплексы типа I из дополнительного бактериального штамма, который был особенно устойчивым в работе с множеством целевых участков. Она также показала, что домен активатора можно заменить на репрессор, чтобы выключить целевые гены. И снова исследователи отметили точность и специфичность, сопоставимую с методами CRISPR / Cas9.
«Мы обнаружили, что структура Cascade является удивительно модульной, что позволяет множеству сайтов прикреплять активаторы или репрессоры, которые являются отличными инструментами для изменения экспрессии генов в клетках человека», – сказал Оливер. "Гибкий характер Cascade делает его перспективной технологией геномной инженерии."
Герсбаха и Оливера побудили исследовать более сложные системы CRISPR класса 1 их коллеги из близлежащего государственного университета Северной Каролины, профессора Родольф Баррангу и Чейз Байзель, который сейчас работает в Центре исследований инфекций им. Гельмгольца в Германии. Баррангу – микробиолог, который изучал естественную биологию различных механизмов защиты CRISPR в течение почти двух десятилетий, а Байзель – инженер-химик, который работал с Баррангу над созданием микроорганизмов с системами CRISPR класса 1. Им обоим было любопытно, может ли лаборатория Герсбаха использовать эти системы в человеческих клетках, подобно тому, как они работали с Cas9.
«Эта работа и полученные в результате технологии – фантастический пример того, как сотрудничество между дисциплинами и между университетами в исследовательском треугольнике Северной Каролины может быть в высшей степени инновационным и продуктивным», – говорит Баррангу, специалист Todd R. Клаенхаммер, заслуженный профессор исследований пробиотиков в Университете штата Северная Каролина.
Теперь команда оптимистично настроена в отношении того, что их исследование и связанная с ним работа других специалистов в этой области будет стимулировать новые исследования систем CRISPR класса 1.
«Целью этого проекта было изучение разнообразия систем CRISPR», – сказал Герсбах. «За последнее десятилетие были опубликованы тысячи статей о CRISPR-Cas9, но мы постоянно узнаем о нем что-то новое. В этом исследовании мы применяем этот образ мышления к остальным 90% того, что нас интересует."
На данный момент команда показала, что эти системы класса 1 сопоставимы с CRISPR-Cas9 с точки зрения точности и применения. Обдумывая будущие направления, им любопытно изучить, чем эти системы отличаются от своих аналогов класса 2 и как эти различия могут оказаться полезными для биотехнологических приложений.
Команда также заинтересована в изучении того, как системы класса 1 могут решать общие проблемы для исследований CRISPR-Cas, особенно проблемы, которые усложняют потенциальные терапевтические применения, такие как иммунные ответы на белки Cas и одновременное использование нескольких типов CRISPR для различных функций инженерии генома.
«Мы знаем, что CRISPR может иметь большое влияние на здоровье человека», – сказал Герсбах. «Но мы все еще находимся в самом начале понимания того, как CRISPR будет использоваться, что он может делать и какие системы нам доступны. Мы ожидаем, что этот новый инструмент откроет новые области геномной инженерии."