Происходит несколько процессов для производства зрелых мРНК, которые затем могут быть экспортированы в цитоплазму и использованы в качестве матрицы для синтеза белка. После инициации транскрипции и продолжения элонгации для производства пре-мРНК интроны необходимо сплайсировать, а экзоны, кодирующие белок, соединить. Сначала пре-мРНК представляет собой комплементарную последовательность ДНК, но с немного другим химическим составом и включает все интроны. Затем сплайсосомный аппарат, состоящий примерно из 300 белков, собирается «котранскрипционно» в каждом интронном соединении по мере того, как РНК возникает в результате своего синтеза. «Сплайсинг – невероятно сложный процесс из-за большого количества задействованных белков, которые постоянно необходимо собирать и разбирать на каждом стыке.
Кроме того, скорость, с которой транскрипция генерирует РНК, довольно высока, поэтому процесс сплайсинга должен быть хорошо организован. Многие шаги могут пойти не так, как надо, и привести к различным патологиям, поэтому так важно лучше понимать, как происходит сращивание и как оно регулируется », – сказал Беди.
Команда начала свое исследование с анализа большого набора данных Bru-seq, которые лаборатория Люнгмана накопила за последние 10 лет, и остановилась на шести клеточных линиях, которые имели достаточно глубокие данные для всестороннего анализа эффективности сплайсинга в масштабах всего генома.
Технология Bru-seq была разработана в лаборатории Люнгмана и основана на избирательном захвате вновь синтезированной РНК, меченной бромуридином. После сбора возникающие РНК, меченные Bru, были секвенированы в Advanced Genomics Core Мичиганского университета, и Беди использовал специально разработанный конвейер вычислительного анализа для анализа эффективности сплайсинга в этих наборах данных.
«Вы должны уметь использовать образцы с достаточной глубиной чтения для анализа эффективности сплайсинга на стыках между интронами и экзонами», – пояснил Беди. Для этого он объединил данные секвенирования из многих экспериментов.
Помимо 300 белков, удаляющих интроны, в процессе сплайсинга участвуют и другие регулирующие факторы. Авторы идентифицировали ряд РНК-связывающих белков, которые, как было показано, имеют разную степень связывания с интронами, экзоном или соединением между ними.
Беди завершил свое интервью загадочным вопросом, открытым для исследования: чтобы иметь белок, клетке нужны правильно сплайсированные мРНК. Зачем же тогда клетка тратит столько энергии на создание неточно сплайсированных РНК?? Юнгман отмечает, что включение интронов в наши гены послужило важной цели во время эволюции высших эукариот, поскольку позволило увеличить разнообразие белков за счет «перетасовки» кодирующих последовательностей экзонов. «Если бы сплайсинг был полностью точным и эффективным каждый раз, разнообразие кодирующих белок последовательностей было бы намного меньше, и, таким образом, мы считаем, что эволюция должна была сформировать определенную степень« небрежности »в процессе сплайсинга. «Наше исследование является наиболее полным исследованием котранскрипционного сплайсинга в масштабах всего генома на сегодняшний день, и оно четко документирует вариабельность процесса сплайсинга между генами и типами клеток», – добавил Юнгман.
Сплайсинг – это область исследований, в которой еще многое предстоит изучить и открыть. Фундаментальные вопросы биологии и развитие технологий идут рука об руку, чтобы найти ответы, которые способствуют пониманию процесса сплайсинга и разработке лекарств от различных заболеваний, вызванных аберрантным сплайсингом.
Матс Люгман – профессор радиационной онкологии и наук о здоровье окружающей среды и директор лаборатории Bru-Seq. Он также является со-директором Центра РНК-биомедицины Мичиганского университета, одним из двух основных объектов которого является лаборатория Bru-Seq. Области компетенции этой лаборатории – выделение РНК, подготовка библиотеки кДНК и анализ данных секвенирования.
Лаборатория Bru-Seq обслуживает исследователей из Мичиганского университета и других учреждений США и всего мира.