Еще в 1980-х годах ученые обнаружили определенные хлоридные каналы, которые активировались кальцием. Однако только в 2008 году было обнаружено, что фактическая молекулярная идентичность этих каналов принадлежит семейству TMEM16. «Эти каналы можно использовать для лечения муковисцидоза – заболевания, при котором транспорт хлоридов в легких и других органах нарушается», – говорит Паулино. Впоследствии в геноме человека были обнаружены десять различных генов TMEM16, но когда их функция была изучена, результат оказался неожиданным.
Два гена действительно кодируют хлоридные каналы, но остальные представляют собой скрамблазы – белки, которые перемещают фосфолипиды между обеими сторонами липидного бислоя.’
Смерть клетки
Липидный состав клеточных мембран асимметричен: внутренний и внешний монослой содержат разные фосфолипиды. Перемещая определенные фосфолипиды с одной стороны мембраны на другую, скрамблазы нарушают асимметрию. «Это может быть очень сильным сигналом», – объясняет Паулино.
Например, когда липиды, которые в противном случае расположены на внутренней стороне мембраны, присутствуют снаружи, это может служить сигналом для индукции гибели клеток. Или, в случае липидной скрамблазы TMEM16F, для инициации свертывания крови в тромбоцитах.Таким образом, строгое регулирование активности скрамблазы имеет жизненно важное значение. Однако, что еще больше усложняет ситуацию, некоторые из этих белков скрамблазы также действуют как неселективные ионные каналы.
В качестве постдока в лаборатории Раймунда Дутцлера (ныне ее соавтор) Паулино решила крио-ЭМ структуру TMEM16A, члена семейства TMEM16, которая работает исключительно как канал. Все стало на свои места, когда она сравнила эту структуру с рентгеновской структурой грибковой скрамблазы nhTMEM16: «Оба исследования определили отличительные черты этого бифункционального семейства.
Мы могли понять, как подобная архитектура белка может адаптироваться для выполнения этих различных задач. В то время как в структуре липидного скрамблаза мы наблюдали проходящую через мембрану и доступную для мембран полость, через которую могут проходить липиды, борозда закрывается в структуре хлоридного канала, образуя пору, которая обеспечивает диффузию ионов через мембрану.’
Скрамбласы
Однако остались большие вопросы: «Мы хотели знать, как скрамблазы регулируются кальцием и как некоторые из них могут одновременно способствовать переносу ионов».С этой целью ее недавно созданная исследовательская группа в Университете Гронингена вместе с группой Дутцлера в Цюрихе, Швейцария, приступила к изучению белка TMEM16F млекопитающих, который играет решающую роль в свертывании крови. Они решили структуру белка в средах с кальцием и без него, чтобы уловить открытое и закрытое состояние.
Однако ни одна из крио-ЭМ-структур не показала открытого состояния с полостью, через которую могли бы транспортироваться фосфолипиды и ионы. «Была лишь небольшая разница в структурах с кальцием и без него», – объясняет Паулино.
Есть несколько возможных объяснений: липиды могли транспортироваться без образования водной полости, или экспериментальные условия были просто неоптимальными для того, чтобы белок принял «открытое» состояние. Эффект мутаций в разных местах сделал первый вариант маловероятным. Но чтобы добиться прогресса, требовалось больше информации.
Поэтому мы решили вернуться к нашим исследованиям грибка nhTMEM16.’
Не черно-белый
Эти эксперименты оказались более успешными. Паулино и ее коллеги наблюдали открытое состояние с бороздой, по которой могли переноситься фосфолипиды; закрытое состояние; и промежуточное состояние, которое могло бы позволить ионный транспорт. ‘Действительно, мы обнаружили все три состояния в присутствии кальция, который должен вызывать открытое состояние.
Таким образом, наши результаты показывают, что структура очень динамична, с равновесием между различными состояниями.Это также означает, что должен существовать дополнительный фактор, регулирующий активность белков TMEM16, помимо кальция, потому что в клетках активность этих белков жестко регулируется.
Паулино и ее коллеги прошли долгий путь в понимании того, как работают белки семейства TMEM16. «Теперь мы знаем, что это не черно-белая ситуация: множественные белковые конформации находятся в динамическом равновесии.В полностью открытом состоянии они представляют собой скрамблазы, а в промежуточном состоянии они могут переносить ионы.
Это предполагает, что эти белки изначально были скрамблазами, но некоторые из них превратились в чистые ионные каналы, возможно, в результате мутаций, которые благоприятствовали промежуточной форме белка.
Динамика
Для понимания сложного механизма действия белков TMEM16 потребовалось огромное количество структурных и функциональных данных. Для Паулино исследование еще раз подтверждает силу крио-ЭМ как исследовательского инструмента: «Это позволило нам проанализировать динамику активной структуры и увидеть несколько различных состояний, в которых может находиться белок.’