«В течение некоторого времени мы пытались изменить геномы рептилий и манипулировать генами рептилий, но мы застряли в режиме редактирования генов в основных модельных системах», – говорит автор-корреспондент Дуг Менке. , доцент Университета Джорджии. «Мы хотели изучить аноловых ящериц, чтобы изучить эволюцию регуляции генов, поскольку они пережили серию событий видообразования на Карибских островах, как зяблики Дарвина на Галапагосских островах."
В большинстве модельных систем редактирование генов выполняется путем введения реагентов для редактирования генов CRISPR-Cas9 в свежеоплодотворенные яйца или одноклеточные зиготы. Но этот метод нельзя использовать для рептилий, говорит Менке, потому что у ящериц происходит внутреннее оплодотворение, и время оплодотворения невозможно предсказать.
Изолированный одноклеточный эмбрион самки ящерицы также не может быть легко перенесен, что делает практически невозможным манипулирование за пределами ящерицы.
Но Менке и его исследовательская группа заметили, что прозрачная мембрана над яичником позволяет им видеть все развивающиеся яйцеклетки, включая те, которые собирались овулировать и оплодотворять в следующий раз. Они решили ввести реагенты CRISPR в неоплодотворенные яйца в яичниках и посмотреть, будет ли CRISPR по-прежнему работать.
"Поскольку мы вводим неоплодотворенные яйцеклетки, мы думали, что сможем выполнить редактирование генов только для аллелей, унаследованных от матери. Отцовской ДНК нет в этих неоплодотворенных ооцитах », – говорит Менке. "Нам пришлось ждать три месяца, пока ящерицы вылупятся, так что это немного похоже на редактирование генов в замедленном режиме.
Но оказывается, что когда мы проделали эту процедуру, примерно у половины созданных нами мутантных ящериц были события редактирования генов на материнском аллеле и отцовском аллеле."
Это говорит о том, что компоненты CRISPR остаются активными в течение нескольких дней или даже недель в неоплодотворенных яйцах. После скрининга потомства исследователи обнаружили, что от 6% до 9% ооцитов, в зависимости от их размера, давали потомство с событиями редактирования генов.
«По сравнению с хорошо зарекомендовавшими себя модельными системами, эффективность которых может достигать 80% или выше, 6% кажутся низкими, но никто раньше не мог выполнять такого рода манипуляции с какой-либо рептилией», – говорит Менке. "Не существует большого сообщества генетиков развития, изучающих рептилий, поэтому мы надеемся задействовать захватывающую функциональную биологию, которая до сих пор не исследована."
Менке говорит, что у его команды было две причины сделать ящериц альбиносами, а не редактировать другие признаки. Во-первых, когда ген тирозиназного альбинизма отключен, это приводит к потере пигментации без смертельного исхода для животного. Во-вторых, поскольку люди с альбинизмом часто имеют проблемы со зрением, исследователи надеются использовать ящериц в качестве модели для изучения того, как потеря этого гена влияет на развитие сетчатки.
"У людей и других приматов есть особенность глаза, называемая ямкой, которая представляет собой ямчатую структуру сетчатки, которая имеет решающее значение для остроты зрения. Ямка отсутствует в основных модельных системах, но присутствует у аноловых ящериц, поскольку они полагаются на острое зрение, чтобы охотиться на насекомых », – говорит Менке.
По словам Менке, изучение функций генов у рептилий открывает новые возможности для изучения аспектов развития, которые лучше всего изучены на неустановленных моделях животных. И, в конце концов, этот метод редактирования генов можно было бы применить на других животных.
«Мы никогда не знаем, откуда появятся следующие важные идеи, и если мы не можем даже изучить, как гены работают в огромной группе животных, то нет никакого способа узнать, исследовали ли мы все, что можно исследовать. область функций генов у животных ", – говорит Менке. "Каждому виду, несомненно, есть что сказать нам, если мы потратим время на разработку методов редактирования генов."