Под руководством аспиранта UCSF Майкла Шуфа группа исследователей разработала полностью синтетическую, готовую к производству молекулу, которая закрывает важнейший механизм SARS-CoV-2, позволяющий вирусу инфицировать наши клетки. Как сообщается в новой статье, теперь доступной на сервере препринтов bioRxiv, эксперименты с использованием живого вируса показывают, что эта молекула является одним из самых эффективных противовирусных препаратов SARS-CoV-2, которые были обнаружены.
В тестируемом аэрозольном составе, который исследователи назвали «AeroNabs», эти молекулы можно вводить самостоятельно с помощью назального спрея или ингалятора.
При использовании один раз в день AeroNabs может обеспечить мощную и надежную защиту от SARS-CoV-2 до тех пор, пока вакцина не станет доступной. Исследовательская группа ведет активные переговоры с коммерческими партнерами о наращивании производства и клинических испытаний AeroNabs.
Если эти тесты будут успешными, ученые стремятся сделать AeroNabs широко доступным в качестве недорогого безрецептурного лекарства для профилактики и лечения COVID-19.
«Намного более эффективные, чем носимые формы средств индивидуальной защиты, мы думаем об AeroNabs как о молекулярной форме СИЗ, которая могла бы служить важным временным барьером до тех пор, пока вакцины не обеспечат более постоянное решение проблемы COVID-19», – сказал соавтор AeroNabs Питер Уолтер.
Доктор философии, профессор биохимии и биофизики в UCSF и исследователь Медицинского института Говарда Хьюза. По словам Уолтера, для тех, кто не может получить доступ к вакцинам против SARS-CoV-2 или не реагирует на них, AeroNab может стать более надежной линией защиты от COVID-19.
«Мы собрали невероятную группу талантливых биохимиков, клеточных биологов, вирусологов и структурных биологов, чтобы выполнить проект от начала до конца всего за несколько месяцев», – сказал Шуф, сотрудник лаборатории Уолтера и соавтор AeroNabs.
Дизайн, вдохновленный ламами
Хотя AeroNab были разработаны полностью в лаборатории, они были созданы на основе нанотел, иммунных белков, подобных антителам, которые естественным образом встречаются у лам, верблюдов и родственных им животных.
С момента их открытия в бельгийской лаборатории в конце 1980-х уникальные свойства нанотел заинтриговали ученых всего мира.
«Хотя они действуют так же, как антитела, обнаруженные в иммунной системе человека, нанотела предлагают ряд уникальных преимуществ для эффективных терапевтических средств против SARS-CoV-2», – объяснил соавтор изобретения Аашиш Манглик, доктор медицинских наук, доцент кафедры фармацевтической химии. который часто использует нанотела в качестве инструмента в своих исследованиях структуры и функций белков, которые отправляют и принимают сигналы через клеточную мембрану.
Например, нанотела на порядок меньше человеческих антител, что упрощает манипуляции с ними и их изменение в лаборатории. Их небольшой размер и относительно простая структура также делают их значительно более стабильными, чем антитела других млекопитающих. Кроме того, в отличие от человеческих антител, нанотела можно легко и недорого производить массово: ученые вставляют гены, содержащие молекулярные схемы, для создания нанотел в E. coli или дрожжи, и превратить эти микробы в высокопроизводительные фабрики нанотел.
Тот же метод безопасно использовался на протяжении десятилетий для массового производства инсулина.
Но, как заметил Манглик, «нанотела были для нас лишь отправной точкой. Хотя они и привлекательны сами по себе, мы думали, что можем улучшить их с помощью белковой инженерии. В конечном итоге это привело к разработке AeroNabs."
Спайк – ключ к инфекции
SARS-CoV-2 полагается на свои так называемые спайковые белки для заражения клеток.
Эти шипы покрывают поверхность вируса и придают вид короны при просмотре в электронный микроскоп – отсюда и название вирусного семейства, которое включает SARS-CoV-2, «коронавирус». Однако шипы – это больше, чем просто украшение – они являются важным ключом, который позволяет вирусу проникать в наши клетки.
Как и выдвижной инструмент, шипы могут переключаться из закрытого неактивного состояния в открытое активное состояние. Когда какой-либо из примерно 25 спайков вирусной частицы становится активным, три «рецептор-связывающих домена» или RBD этого спайка становятся доступными и приготавливаются для присоединения к ACE2 (произносится как «ace two»), рецептору, обнаруженному в клетках человека, легкие и дыхательные пути.
Благодаря взаимодействию типа «замок-и-ключ» между рецептором ACE2 и шиповым RBD вирус проникает в клетку, где затем превращает своего нового хозяина в производителя коронавируса. Исследователи полагали, что, если они смогут найти нанотела, которые препятствуют взаимодействиям спайк-ACE2, они смогут предотвратить заражение вирусом клеток.
Нанотела отключают шипы и предотвращают заражение
Чтобы найти эффективных кандидатов, ученые проанализировали недавно разработанную библиотеку в лаборатории Манглика, содержащую более 2 миллиардов синтетических нанотел. После последовательных раундов тестирования, в ходе которых они вводили все более строгие критерии для исключения слабых или неэффективных кандидатов, ученые получили 21 нанотело, которое не позволяло модифицированной форме шипа взаимодействовать с ACE2.
Дальнейшие эксперименты, в том числе использование криоэлектронной микроскопии для визуализации интерфейса нанотело-шип, показали, что наиболее мощные нанотела блокируют взаимодействия шип-ACE2, прочно прикрепляясь непосредственно к RBD шипа. Эти нанотела действуют как оболочка, которая закрывает «ключ» RBD и предотвращает его вставку в замок ACE2."
Имея в своем распоряжении эти результаты, исследователям все еще необходимо было продемонстрировать, что эти нанотела могут предотвратить заражение клеток настоящим вирусом. Вероника Резель, доктор философии, вирусолог из лаборатории Марко Виннуцци, доктора философии, в Институте Пастера в Париже, проверила три наиболее многообещающих нанотела против живого SARS-CoV-2 и обнаружила, что нанотела обладают необычайной эффективностью, предотвращая заражение даже при очень сильном заражении. низкие дозы.
Однако наиболее мощные из этих нанотел действуют не только как оболочка над RBD, но и как молекулярная мышеловка, зажимая шип в его закрытом, неактивном состоянии, что добавляет дополнительный уровень защиты от взаимодействий шип-ACE2, которые привести к инфекции.
От нанотел к AeroNabs
Затем ученые разработали это нанотело двойного действия несколькими способами, чтобы превратить его в еще более мощное противовирусное средство. В одной серии экспериментов они мутировали каждый из аминокислотных строительных блоков нанотела, который контактирует с шипом, чтобы обнаружить два специфических изменения, которые привели к 500-кратному увеличению эффективности.
В отдельной серии экспериментов они сконструировали молекулярную цепочку, которая могла бы связать три нанотела вместе.
Как уже отмечалось, каждый спайковый белок имеет три RBD, любой из которых может присоединяться к ACE2, чтобы обеспечить проникновение вируса в клетку. Связанное тройное нанотело, разработанное исследователями, гарантировало, что если одно нанотело прикрепится к RBD, два других присоединятся к оставшимся RBD.
Они обнаружили, что это тройное нанотело в 200000 раз более мощное, чем одно только одно нанотело.
И когда они воспользовались результатами обеих модификаций, соединив вместе три мощных мутировавших нанотела, результаты оказались «зашкаливающими», – сказал Уолтер. "Он был настолько эффективным, что превзошел наши возможности измерить его эффективность."
Было бы легко вводить в виде аэрозоля
Эта сверхмощная конструкция из трех частей нанотела легла в основу AeroNabs.
В заключительной серии экспериментов исследователи подвергли трехкомпонентные нанотела серию стресс-тестов, подвергли их воздействию высоких температур, превратили их в стабильный при хранении порошок и создали аэрозоль. Каждый из этих процессов сильно повреждает большинство белков, но ученые подтвердили, что, благодаря присущей нанотелам стабильности, не было потери противовирусной активности в аэрозольной форме, что позволяет предположить, что AeroNabs являются мощным противовирусным средством SARS-CoV-2, которое может быть практичным для введения через ингалятор длительного хранения или назальный спрей.
«Не только мы думаем, что AeroNab – замечательная технология», – сказал Манглик. «Наша команда ведет постоянные обсуждения с потенциальными коммерческими партнерами, которые заинтересованы в производстве и распространении AeroNabs, и мы надеемся вскоре начать испытания на людях.
Если AeroNab окажутся столь же эффективными, как мы ожидаем, они могут помочь изменить ход пандемии во всем мире."
Авторы: Дополнительные авторы: Брайан Фауст, Рубен А. Сондерс, Смрити Сангван, Ник Хоппе, Морган Бун, Кристиан Бач Биллесболле, Марселл Зимани, Ишан Дешпанде, Цзяхао Лян, Адитья А. Ананд, Нив Добзински, Бет Шошана Жа, Бенджамин Барси-Райн, Владислав Белый, Силке Нок и Ювэй Лю из UCSF; Камилла Р. Симоно, Кристоффер Леон, Неван Дж.
Кроган, Даниэль Л. Свани и Мелани Отт из Института количественных биологических наук UCSF (QBI) и J. Институты Дэвида Гладстона; Эндрю В. Барил-Хилл из Cytiva Life Sciences; Саян Гупта и Кори Y. Ральстон из Национальной лаборатории Лоуренса Беркли; Крис М Уайт и Адольфо Гарси?а-Састре из Медицинской школы Икана на горе Синай; и Консорциум структурной биологии QBI Coronavirus Research Group. Шуф, Фауст, Сондерс, Сангван и Резель – соавторы рукописи.
Финансирование: эта работа была поддержана Фондом реагирования на COVID-19 UCSF, грантом от Allen & Company и сторонниками программы UCSF для прорывных биомедицинских исследований (PBBR), которая была создана при поддержке Фонда Сандлера. Другая поддержка включала гранты Национальных институтов здравоохранения (NIH) DP5OD023048, S10OD020054, S10OD021741, 1R01GM126218; Грант Лаборатории высших достижений ANR-10-LABX-62-IBEID; кампания по сбору средств URGENCE COVID-19 Institut Pasteur; Управление науки и Управление биологических и экологических исследований Университета.S.
Министерство энергетики по контракту DE-AC02-05CH11231; докторская стипендия Хелен Хэй Уитни; Фонд Альфреда Бензона; подарок от Фонда Родденберри; Медицинский институт Говарда Хьюза; Благотворительные фонды Пью; Эстер А. И Фонд Джозефа Клингенштейна; и Программа стипендиатов Сирла.
Раскрытие информации: Шуф, Фауст, Сондерс, Хоппе, Уолтер и Манглик являются изобретателями предварительного патента, описывающего нанотела против Спайка, описанные в рукописи.