Чтобы лучше понять сложные отношения между генетическими зависимостями хозяина и вируса, команда использовала широкий спектр аналитических и экспериментальных методов для проверки своих результатов. Этот интегративный подход включал редактирование генома, секвенирование отдельных клеток, конфокальную визуализацию и вычислительный анализ экспрессии генов и протеомных наборов данных.
Исследователи обнаружили, что эти новые гены-мишени, когда они ингибируются с помощью небольших молекул (лекарств), значительно снижают вирусную нагрузку, а с некоторыми лекарствами – до 1000 раз. Их результаты дают представление о новых методах лечения, которые могут быть эффективны при лечении COVID-19, и раскрывают основные молекулярные мишени этих методов лечения.
«Видя трагические последствия COVID-19 здесь, в Нью-Йорке, и во всем мире, мы почувствовали, что можем использовать высокопроизводительные инструменты редактирования генов CRISPR, которые мы применили к другим заболеваниям, чтобы понять, какие ключевые гены человека требуются для Вирус SARS-CoV-2 ", – сказал соавтор исследования доктор.
Невилл Санджана, главный преподаватель Нью-Йоркского центра генома, доцент кафедры биологии Нью-Йоркского университета и доцент кафедры неврологии и физиологии Медицинской школы Гроссмана Нью-Йоркского университета. Ранее доктор.
Санджана применил CRISPR-экраны на уровне всего генома для выявления генетических факторов различных заболеваний, включая лекарственную устойчивость при меланоме, неудачи иммунотерапии, метастазирование рака легких, врожденный иммунитет, врожденные нарушения обмена веществ и мышечную дистрофию.
Для этого проекта редактирование генома было лишь половиной уравнения. «Ранее мы разработали серию моделей клеток человека для коронавирусной инфекции в нашей работе, чтобы понять иммунные реакции на вирус. Было здорово объединиться с группой Невилла, чтобы понять и всесторонне профилировать гены хозяина под новым углом », – сказал соавтор исследования д-р. Бенджамин тенУвер, профессор медицины Фишберга, ученый Икана и профессор микробиологии Медицинской школы Икана на горе Синай.
Кластеры генов впереди
Команда обнаружила, что лучшие гены – те, чья потеря существенно снижает вирусную инфекцию – сгруппированы в несколько белковых комплексов, включая вакуолярные АТФазы, Retromer, Commander, Arp2 / 3 и PI3K.
Многие из этих белковых комплексов участвуют в транспортировке белков к клеточной мембране и от нее.
"Нам было очень приятно видеть, что несколько генов в одной семье заняли первое место на нашем полногеномном экране. Это вселило в нас высокую степень уверенности в том, что эти белковые семейства имеют решающее значение для жизненного цикла вируса, будь то попадание в клетки человека или успешная репликация вируса », – сказал д-р.
Жарко Данилоски, научный сотрудник Sanjana Lab и соавтор исследования.
В то время как исследователи проводили CRISPR-скрининг с использованием клеток легких человека, команда также изучала, является ли экспрессия необходимых генов хозяина легкоспецифичной или выражается более широко. Среди топовых генов только ACE2, рецептор, который, как известно, отвечает за связывание вирусного белка Spike SARS-CoV-2, продемонстрировал тканеспецифичную экспрессию, а остальные топовые гены широко экспрессировались во многих тканях, что позволяет предположить, что эти механизмы могут функционировать независимо от типа клетки или ткани. Используя протеомные данные, они обнаружили, что несколько ведущих генов-хозяев напрямую взаимодействуют с собственными белками вируса, что подчеркивает их центральную роль в жизненном цикле вируса.
Команда также проанализировала общие гены хозяина, необходимые для других вирусных патогенов, таких как вирус Зика или пандемический грипп H1N1.
Механистические выводы: холестерин и вирусные рецепторы
После завершения первичного скрининга группа исследователей использовала несколько различных методов, чтобы подтвердить роль многих из ведущих генов в вирусной инфекции.
Используя линии клеток человека, полученные из легких и других органов, восприимчивых к инфекции SARS-CoV-2, они измерили вирусную инфекцию после нокаута гена с помощью CRISPR, подавления гена с помощью интерференции РНК или ингибирования лекарственного средства. Убедившись, что эти манипуляции снижают вирусную инфекцию, они затем попытались понять механизмы, с помощью которых потеря этих генов блокирует коронавирусную инфекцию.
Используя недавно разработанную технологию, которая сочетает крупномасштабное редактирование CRISPR с секвенированием одноклеточной РНК (ECCITE-seq), команда определила, что потеря нескольких первоклассных генов приводит к усилению регуляции путей биосинтеза холестерина и увеличению клеточного холестерина. Используя это понимание, они изучили эффекты амлодипина, препарата, изменяющего уровень холестерина.
«Мы обнаружили, что амлодипин, антагонист кальциевых каналов, повышает уровень клеточного холестерина и блокирует инфекцию SARS-CoV-2.
Поскольку недавние клинические исследования также показали, что пациенты, принимающие блокаторы кальциевых каналов, имеют более низкий уровень летальности от COVID-19, важным направлением будущих исследований будет дальнейшее изучение взаимосвязи между путями синтеза холестерина и SARS-CoV-2 ", – сказал доктор. Тристан Джордан, научный сотрудник лаборатории tenOever Lab и соавтор исследования.
Основываясь на предыдущей работе по мутациям в белке Spike и проникновению вируса через рецептор ACE2, исследовательская группа также спросила, может ли потеря некоторых генов придать устойчивость к коронавирусу за счет снижения уровня ACE2. В частности, они идентифицировали один ген, RAB7A, который оказывает большое влияние на перенос ACE2 на клеточную мембрану.
Используя комбинацию проточной цитометрии и конфокальной микроскопии, команда показала, что потеря RAB7A предотвращает проникновение вируса за счет секвестрации рецепторов ACE2 внутри клеток.
«Текущие методы лечения инфекции SARS-CoV-2 в настоящее время основаны на самом вирусе, но это исследование предлагает лучшее понимание того, как гены хозяина влияют на проникновение вируса, и откроет новые возможности для терапевтических открытий и, надеюсь, ускорит выздоровление для восприимчивых популяций», – сказал д-р.
Санджана.