В исследовании, опубликованном 16 июня в журнале Nature, исследователи описывают новую технику, основанную на стратегии, используемой для улучшения разрешения в световой микроскопии.
Для изучения белков и других биомолекул с высоким разрешением исследователи долгое время использовали два метода: рентгеновскую кристаллографию и криоэлектронную микроскопию. Хотя оба метода могут определять молекулярные структуры вплоть до разрешения отдельных атомов, они делают это на молекулах, которые либо превращены в кристаллы, либо заморожены при сверхнизких температурах, что, возможно, изменяет их нормальную физиологическую форму.
С помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) можно анализировать биологические молекулы в нормальных физиологических условиях, но полученные изображения были размытыми и с низким разрешением.
«Атомно-силовая микроскопия может легко разрешить атомы в физике, на твердых поверхностях силикатов и на полупроводниках, поэтому это означает, что в принципе машина обладает достаточной точностью для этого», – сказал старший автор исследования д-р. Саймон Шеринг, профессор физиологии и биофизики анестезиологии Weill Cornell Medicine. «Техника немного похожа на то, как если бы вы взяли ручку и отсканировали Скалистые горы, чтобы получить топографическую карту объекта.
На самом деле наша ручка – это игла, острая до нескольких атомов, а объекты – отдельные белковые молекулы."
Однако биологические молекулы имеют множество мелких частей, которые извиваются, размывая изображения, полученные при АСМ.
Чтобы решить эту проблему, доктор. Шейринг и его коллеги адаптировали концепцию световой микроскопии под названием микроскопия сверхвысокого разрешения. «Теоретически с помощью оптической микроскопии невозможно разрешить две флуоресцентные молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем половина длины волны света», – сказал он. Однако, стимулируя соседние молекулы к флуоресценции в разное время, микроскописты могут анализировать распространение каждой молекулы и определять их местоположение с высокой точностью.
Вместо стимуляции флуоресценции Dr. Команда Шеринга отметила, что естественные колебания биологических молекул, зарегистрированные в ходе сканирования AFM, дают аналогичные разбросы позиционных данных.
Первый автор Dr. Джордж Хит, который был научным сотрудником докторантуры Weill Cornell Medicine на момент исследования, а сейчас является преподавателем Университета Лидса, участвовал в циклах экспериментов и компьютерных симуляций, чтобы более подробно понять процесс построения изображений АСМ и извлечь максимум информации об атомных взаимодействиях между зондом и образцом.
Используя такой метод, как анализ со сверхвысоким разрешением, они смогли извлечь изображения движущихся молекул с гораздо более высоким разрешением.
Продолжая топографическую аналогию, д-р. Шеуринг объяснил, что «если камни (я.е., атомов) немного покачиваются вверх и вниз, вы можете обнаружить этот, затем этот, а затем вы усредняете все обнаружения с течением времени и получаете информацию с высоким разрешением."
Поскольку предыдущие исследования АСМ обычно собирали необходимые данные, новый метод может быть применен задним числом к размытым изображениям, создаваемым полем в течение десятилетий.
В качестве примера, новая статья включает анализ АСМ-сканирования мембранного белка аквапорина, первоначально полученного во время Dr. Докторская диссертация Шеринга.
Повторный анализ позволил получить гораздо более четкое изображение, которое близко соответствует структурам молекулы, полученным методом рентгеновской кристаллографии. «Теперь на этих поверхностях вы в основном получаете квазиатомное разрешение», – сказал д-р. Scheuring. Чтобы продемонстрировать мощь этого метода, авторы предоставляют новые данные с высоким разрешением об аннексине, белке, участвующем в репарации клеточной мембраны, и об антипортере протон-хлорид, которого они также сообщают о структурных изменениях, связанных с его функциональными возможностями.
Помимо возможности исследователям изучать биологические молекулы в физиологически значимых условиях, новый метод имеет и другие преимущества. Например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия полагаются на усреднение данных большого количества молекул, но АСМ может генерировать изображения отдельных молекул. «Вместо того, чтобы проводить наблюдения сотен молекул, мы наблюдаем одну молекулу сто раз и рассчитываем карту с высоким разрешением», – сказал д-р.
Scheuring.
Визуализация отдельных молекул, выполняющих свои функции, может открыть совершенно новые типы анализа. «Допустим, у вас есть [вирусный] спайковый белок, который находится в одной конформации, а затем он активируется и переходит в другую конформацию», – сказал доктор.
Scheuring. "В принципе, вы могли бы рассчитать карту с высоким разрешением для той же самой молекулы, когда она переходит от одной конформации к другой, а не для тысяч молекул в той или другой конформации."Такие данные об отдельных молекулах с высоким разрешением могут предоставить более подробную информацию и избежать потенциально вводящих в заблуждение результатов, которые могут возникнуть при усреднении данных по множеству молекул. Кроме того, карта может выявить новые стратегии для точного перенаправления или прерывания таких процессов.
В число соавторов дополнительных исследований входят доктора.
Екатерина Коц, Шифра Лански, Георгий Хелашвили и Харел Вайнштейн из отделения физиологии и биофизики Weill Cornell Medicine and Dr. Дженис Робертсон с факультета биохимии и молекулярной биофизики Вашингтонского университета.