Исследование, проведенное под руководством Чуньсяо Сонга и Бенджамина Шустер-Бёклера, обоих ассистентов из Института исследований рака Людвига в Оксфорде, демонстрирует, что их метод, получивший название секвенирования пиридинборана с помощью TET, или TAPS, является менее разрушительной и более эффективной заменой для бисульфитное секвенирование, текущий золотой стандарт для картирования эпигенетических модификаций ДНК.
«Мы думаем, что TAPS может напрямую заменить бисульфитное секвенирование в качестве нового стандарта эпигенетического секвенирования ДНК», – сказал Сонг. "Это делает эпигенетическое секвенирование ДНК более доступным и доступным для более широкого круга академических исследований и клинических приложений."
Один класс эпигенетических модификаций включает присоединение химических групп к одной из четырех «букв» или оснований ДНК. Эти метки не изменяют саму последовательность ДНК, а скорее влияют на включение и выключение генов. Две из наиболее распространенных модификаций этого типа включают добавление химических метильных и гидроксиметильных групп к цитозину с образованием 5-метилцитозина (5mC) и 5-гидроксиметилцитозина (5hmC). «Аномальные образцы содержания 5mC и 5hmC являются классическими признаками рака», – сказал Сонг.
На протяжении десятилетий биологи полагались на бисульфит для обнаружения модификаций 5mC и 5hmC, но это химическое вещество чрезвычайно разрушительно, разрушая до 99% ДНК, с которой оно контактирует. «Вы можете себе представить, что если вы имеете дело с очень ограниченными генетическими образцами, такими как внеклеточная ДНК, циркулирующая в крови, секвенирование бисульфита становится очень сложной задачей», – сказал Сонг.
Еще одно ограничение бисульфитного секвенирования заключается в том, что оно определяет 5mC и 5hmC только косвенно. Этот метод преобразует немодифицированный цитозин в родственное основание, называемое урацилом, при этом метилированный цитозин остается нетронутым. "Это очень неэффективно и требует больших вычислений", – сказал Сонг. "Это все равно, что искать Уолли, устраняя всех, кто не Уолли.
TAPS позволяет нам найти Уолдо напрямую."
Новый метод состоит из двух этапов.
Первый использует фермент, известный как ТЕТ, для преобразования 5mC и 5hmC в третью модификацию, 5-карбоксилцитозин (5caC). Второй шаг включает в себя новую химическую реакцию, разработанную Ибинем Лю, докторантом в лаборатории Сун, для преобразования 5caC в тимин – основание ДНК, которое можно прочитать с помощью обычных секвенирующих машин.
Процесс генерировал новый тип данных, и лаборатория Schuster-Boeckler разработала вычислительную методологию, необходимую для их анализа. «По сравнению с бисульфитным секвенированием обработка данных TAPS не только в два раза быстрее, но и позволяет сохранить гораздо больше информации из исходного образца.
Это значительно упрощает обнаружение мутаций и структурных вариаций даже при идентификации модификаций ДНК », – сказал Шустер-Беклер.
После демонстрации того, что основная химия TAPS работает, команда потратила еще один год на его совершенствование, повысив эффективность реакции с 70% до 95%. Исследователи также разработали два варианта метода TAPS – TAPS-Beta и CAPS, которые можно использовать для обнаружения только 5 мкКл или 5 мкКл соответственно.
В тестах с ДНК мыши исследователи показали, что TAPS может генерировать более точные данные секвенирования за половину стоимости бисульфитного секвенирования. «Мы можем получить вдвое больше полезных данных за те же деньги», – сказал Сонг.
Сонг, Шустер-Беклер и его коллеги в настоящее время совершенствуют TAPS для анализа внеклеточной ДНК, выделяемой опухолями в кровоток, с целью применения этого метода для разработки минимально инвазивной диагностики рака.