«Это похоже на нажатие кнопки сброса», – сказал Скот А. Вулф, доктор философии, профессор молекулярной, клеточной и онкологической биологии. "Нам не нужно добавлять какой-либо корректирующий генетический материал, вместо этого клетка сшивает ДНК обратно вместе без дупликации. Это кратчайший путь к генной коррекции с потенциальной терапевтической привлекательностью."
Микродупликации – это изменения в хромосомах, при которых копируются или дублируются небольшие сегменты ДНК.
В некоторых генах эти дупликации могут приводить к так называемым «мутациям сдвига рамки считывания», когда количество добавленных нуклеотидов не делится на три. Это изменяет трансляцию гена в белок, вызывая потерю функции. Мутации сдвига рамки, возникающие в результате микродупликаций, вызывают до 143 различных заболеваний, включая мышечную дистрофию конечностей-поясов, синдром Германского-Пудлака и Тея-Сакса.
Доктор.
Вулф, соавтор исследования Nature, является экспертом в CRISPR / Cas9 и других основанных на программируемых нуклеазах методах редактирования генов. Большинство этих методов требуют как создания разрыва цепей ДНК в дефектном гене, так и введения корректирующего генетического материала. Новая последовательность вставляется в разрыв и восстанавливается с помощью врожденного механизма репарации ДНК, обнаруженного в клетках, известного как путь гомологически-направленной репарации. Хотя этот метод коррекции генов является терапевтически многообещающим, он может быть неэффективным и иметь другие технические проблемы.
Вулф и соисследователь Чарльз П. Эмерсон-младший., Доктор философии, профессор неврологии, директор Центра мышечной дистрофии Уэллстона в Медицинской школе Университета Массачусетса и эксперт по развитию скелетных мышц и мышечным дистрофиям, считает, что может быть более прямой подход к лечению заболеваний, вызванных микродупликациями. Они рассудили, что если бы путь соединения концов, опосредованный микрогомологией (MMEJ), мог быть эффективно задействован, вместо пути восстановления, направленного на гомологию, он бы удалил дублированную последовательность и восстановил бы функциональную последовательность гена.
Менее эффективный и более редкий, чем другие механизмы репарации клеток, путь MMEJ часто приводит к делециям по обе стороны от разрыва и отвечает за выполнение небольшого процента репарации ДНК – менее 10 процентов по некоторым оценкам.
Доктор. У Эмерсона была многообещающая цель для оценки возможности этого подхода к редактированию – пояснично-конечностная мышечная дистрофия типа 2G (LGMD2G), вызванная микродупликацией в гене TCAP. Лаборатории Emerson и Wolfe обрабатывали плюрипотентные стволовые клетки, полученные от пациента LGMD2G, нуклеазой Strepetococcus pyogenesCas9 (SpCas9) для нацеливания на разрыв ДНК вблизи центра микродупликации в гене TCAP.
Как они и предсказывали, механизм репарации MMEJ удалил одну копию микродупликации, эффективно сшивая ДНК снова вместе с удивительно высокой эффективностью, исключая мутированный генетический материал и восстанавливая ген, чтобы обеспечить производство нормального белка TCAP.
«Простота и эффективность редактирования гена микродупликации гена TCAP была очень захватывающим моментом открытия и предоставила уникальную возможность разработать терапию для LGMD 2G, которая в настоящее время неизлечима, и это стало нашей ближайшей целью», – сказал Эмерсон.
Сколько болезней вызвано микродупликациями, которые можно лечить с помощью редактирования гена нуклеазы MMEJ?
В сотрудничестве с Кристианом Мюллером, доктором философии, доцентом педиатрии, команда продемонстрировала, что микродупликации в гене HPS1, связанные с синдромом Германски-Пудлака 1 типа, могут быть исправлены в клетках пациентов. Оливер Кинг, доктор философии, доцент неврологии, затем разработал вычислительные инструменты для поиска в базах данных генома человека и обнаружил 143 микродупликации, связанные с болезнями, которые можно было бы лечить с помощью подхода Cas9-MMEJ.
«С этого скромного начала мы полагаем, что простота, надежность и эффективность терапевтической стратегии, основанной на MMEJ, может позволить разработать методы коррекции генов на основе нуклеаз для многих неизлечимых в настоящее время заболеваний», – сказал Вулф.