Исследовательское сотрудничество в Университете штата Колорадо специализируется на флуоресцентной микроскопии высокого разрешения и компьютерном моделировании для визуализации и описания таких жизненных процессов с мельчайшими подробностями в реальном времени на уровне отдельных генов. Теперь ученые во главе с докторантом Линдой Фореро-Кинтеро впервые наблюдали динамику ранней транскрипции РНК, записав, где, когда и как ферменты РНК-полимеразы запускают транскрипцию, связываясь с последовательностью ДНК.
Прорывная технология, подробно описанная в журнале Nature Communications, имеет бесчисленное количество возможных побегов; они включают углубление понимания основных биологических процессов, раскрытие генетических основ определенных заболеваний.
«Это первый раз, когда кто-то изучает динамику фосфорилирования РНК-полимеразы в гене с одной копией», – сказал Фореро, научный сотрудник, научный сотрудником которого является Тим Стасевич, профессор биохимии в Монфорте, и доцент Брайан Мунски. профессор химической и биологической инженерии.
В прошлом такую раннюю транскрипционную активность можно было визуализировать только с помощью массивов генов, которые представляют собой искусственные структуры, состоящие из сотен копий гена и обычно не встречающиеся в ядре клетки.
Стасевич и Мунский возглавляют совместную работу, финансируемую фондом W.M. Фонд Кека и Национальный институт общих медицинских наук (через две премии Maximizing Investigators ‘Research Awards), которые стремятся выявить и количественно оценить генетическую экспрессию в живых одиночных клетках в реальном времени. Фореро, который работает в обеих лабораториях под эгидой сотрудничества, ранее изучал белки и переносчики в клеточных мембранах, связанных с неврологическими состояниями.
Ранняя транскрипционная активность
Как описано в Nature Communications, Forero et al. разработал метод с использованием установленной линии клеток млекопитающих, сконструированных фрагментов флуоресцентных антител и специального микроскопа сверхвысокого разрешения, чтобы запечатлеть процесс ранней транскрипции в ярких цветах: синем, зеленом и красном.
Более конкретно, они наблюдали начало цикла транскрипции, которое происходит, когда фермент транскрипции РНК-полимераза II (RNAP2) становится фосфорилированным или украшенным фосфатными группами на его аминокислотном хвосте.
«Междисциплинарная наука здесь представляет собой фантастическое сочетание новых экспериментальных возможностей и нового подхода к механистическому вычислительному моделированию динамики отдельных ячеек, оба из которых очень новы в своих областях», – сказал Мунски, курирующий вычислительные аспекты сотрудничества.
В лаборатории исследователи загрузили свои фрагменты антител в установленную линию клеток млекопитающих, содержащую репортерный ген, который при транскрибировании освещается флуоресцентно меченным белком. Фрагменты антител, которые Стасевич помог разработать несколько лет назад, помечены флуоресцентными молекулами, которые освещают свои специфические мишени в хвосте RNAP2.
Используя эти технологии тегирования вместе, исследователи смогли выделить три отдельных этапа в цикле транскрипции, отмеченные разными цветами. Изображения, полученные с помощью этой системы, преобразуются в колебания интенсивности флуоресценции.
Затем исследователи использовали эти сигналы для интерпретации пространственно-временной организации фосфорилирования RNAP2 на протяжении всего цикла транскрипции в гене с единственной копией.
Новая информация через вычислительную модель
Команда Мунски во главе с аспирантом Уильямом Раймондом взяла данные микроскопии Фореро и Стасевича и преобразовала их в вычислительную модель, основанную на стохастических дифференциальных уравнениях. Подгоняя эту статистическую модель для воспроизведения всех экспериментальных результатов, вычислительная группа затем расширила свой анализ, чтобы собрать новую механистическую и количественную информацию о различных молекулах и их состояниях в процессе транскрипции.
Например, они оценили, сколько отдельных молекул РНК-полимеразы собираются, чтобы сформировать временные кластеры в области промотора ДНК, как долго эти кластеры сохраняются, и как, когда и где полимеразы распределяются по ДНК. Они обнаружили, например, что каждый всплеск транскрипционной активности приводит к образованию кластера из 5-40 РНК-полимераз вокруг промоторной области гена, 46% из которых в конечном итоге успешно транскрибируют РНК. Они также обнаружили, что для полной транскрипции и обработки каждой РНК перед выпуском требуется около пяти минут.
Фореро говорит, что эта технология имеет далеко идущий потенциал, особенно в сочетании с новыми технологиями, такими как CRISPR, в которых можно выделять определенные гены и манипулировать ими.
Выбор определенного интересующего гена, скажем, вовлеченного в заболевание, и применение считывания исследователями CSU в реальном времени цикла транскрипции может позволить исследователям наблюдать за процессами заболевания, происходящими на уровне активности отдельных генов.
«Способность определять пространственную и временную динамику цикла транскрипции в одном гене является наиболее захватывающим аспектом этой работы», – сказал Фореро.