На недавнем примере ученые, стремящиеся понять механизм фермента, восстанавливающего ДНК, обнаружили, что молекула выполняет свои функции, сначала маркируя, а затем разрушая поврежденную ДНК. Неожиданные выводы команды о белке под названием XPG предоставили столь необходимое понимание того, как восстановление ДНК работает в здоровых клетках, а также как различные мутации могут приводить к различным заболеваниям и раку.
«Мы увидели, что XPG проложила путь к прерывистой ДНК – местам, где были нарушены водородные связи между основаниями на каждой нити спирали, – а затем он очень резко изгибает нить в этом точном месте, нарушая интерфейс, который соединяет основания. сложены друг на друга ", – сказала Сьюзан Цутакава, структурный биолог из области биологических наук в Национальной лаборатории Лоуренса Беркли (лаборатория Беркли) и первый автор работы, опубликованной в этом месяце в PNAS. «Изгибающая активность дополняет и без того впечатляющий арсенал, поскольку XPG впервые был идентифицирован как фермент, расщепляющий ДНК, ответственный за вырезание нуклеотидных оснований при химическом повреждении и повреждении УФ-излучением."
Тем не менее, несмотря на эту способность к разрушению, команда отмечает, что XPG больше похож на мастера-скульптора, чем на команду по сносу.
«Неожиданный вывод из наших данных визуализации заключается в том, что гибкие части белка, которые ранее было невозможно исследовать, обладают способностью распознавать возмущения, связанные со многими различными типами повреждений ДНК», – сказала соавтор Присцилла Купер. биохимик, старший научный сотрудник в области биологических наук. "Затем XPG использует свои моделирующие свойства, чтобы сгибать ДНК, чтобы набирать и загружать на место белки, которые могут исправить этот тип повреждений."
Белок с множеством рабочих мест
Хотя степень того, что XPG делает в клетках человека, все еще изучена лишь частично, ученые давно знали, что этот белок необходим для здоровья человека, наблюдая за разрушительными симптомами, возникающими, когда он отсутствует или не функционирует нормально. Синдром Кокейна, заболевание, характеризующееся прогрессирующим и в конечном итоге фатальным неврологическим спадом, которое начинается в младенчестве, и пигментная ксеродермия, состояние различной степени тяжести, характеризующееся крайней чувствительностью к солнцу и значительно повышенным риском рака кожи, как известно, вызваны мутациями в ген, кодирующий XPG.
Очарованные его многочисленными ролями, Цутакава, Купер и Джон Тайнер, директор по структурной биологии онкологического центра доктора Андерсона Техасского университета и приглашенные преподаватели в области биологических наук, сотрудничали в исследованиях XPG в течение 20 лет.
Трио и их многочисленные коллеги объединяют свой опыт в структурной биологии, молекулярной визуализации, биохимии и клеточной биологии, чтобы они могли составить карту структуры белка и интерпретировать, как его трехмерная форма взаимодействует с ДНК и другими белками. Ранее они обнаружили, что XPG часто связывается с поврежденной ДНК, не задействуя свою способность разрезать ДНК, но не смогли изучить белок достаточно подробно, чтобы выяснить, что он на самом деле делает в этих случаях.
После многих лет разработки технологии, которая могла бы удовлетворить их амбиции, команда наконец смогла построить точную модель каталитического ядра XPG – области, ответственной за активность по разрезанию ДНК, – и получить изображения большого, состоящего из нескольких единиц измерения. общая структура молекулы с использованием трех передовых технологий визуализации.
Они выполнили рентгеновскую кристаллографию в Стэнфордской лаборатории синхротронного излучения и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) на канале SIBYLS передового источника света лаборатории Беркли.
SAXS – это метод, который недавно был разработан, чтобы позволить ученым анализировать гибкие молекулы, свободно перемещающиеся между их естественными состояниями, а не в статических или замороженных формах, как того требует кристаллография. Такой подход крайне необходим для такого белка, как XPG, каталитическое ядро которого составляет лишь четверть всей структуры, а остальная часть состоит из очень гибких «неупорядоченных» областей без формы по умолчанию.
Для визуализации ДНК, связанной с XPG, ученые наняли Джека Гриффита, пионера ротационной теневой электронной микроскопии в Онкологическом центре Линебергера в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл.
Ротационная теневая электронная микроскопия позволяет напрямую визуализировать отдельные молекулы ДНК со связанными с ними белками, в том числе то, как они изгибаются под действием XPG.
«Возможность видеть формы отдельных молекул ДНК дала нам важный ключ к пониманию того, как XPG работает для выявления и обработки поврежденной ДНК», – сказал Гриффит, профессор биохимии и биофизики и эксперт по взаимодействиям белок-ДНК.
Электронная микроскопия также предоставила визуальные доказательства, подтверждающие предыдущее удивительное открытие ученых, что XPG играет роль в гомологичной рекомбинации – процессе репарации ДНК, часто используемом клетками для исправления опасных двухцепочечных разрывов перед репликацией. Это означает, что XPG может оказаться в нужном месте, чтобы помочь известным гомологичным рекомбинационным белкам, таким как BRCA1 и BRCA2, дефекты которых, как известно, вызывают рак.
Между тем кристаллография, выполненная на каталитическом ядре, пролила свет на то, как унаследованные пациентом мутации в гене XPG могут приводить к серьезной дисфункции белка и различным заболеваниям.
Команда создала и протестировала каталитические коровые белки, содержащие каждую из 15 известных точечных мутаций, вызывающих либо пигментную ксеродерму, либо синдром Кокейна, и обнаружила, что эти одиночные аминокислотные замены могут дестабилизировать весь белок, но в разной степени. Свойства остаточного мутантного белка будут определять, в результате чего возникает болезнь. «Эта структура помогает нам понять разницу между двумя заболеваниями, – сказал Купер, – и подчеркивает, насколько сложен белок."
Вдохновленные новой информацией, команда уже начала исследование роли XPG в различных формах рака, а также последующее структурное исследование неупорядоченных областей белка, чтобы узнать больше о его свойствах формирования ДНК.
«Превосходные технические возможности и возможности сотрудничества Berkeley Lab и наших партнеров сделали этот междисциплинарный прорыв осуществимым», – отметил Тайнер.
«Но мы также хотели бы выделить вклад пациентов и их семей», – добавил Цутакава. "Так много из того, что мы обнаружили, стало возможным благодаря тому, что они решили поделиться своими последовательностями ДНК с научным сообществом."