Клетка содержит несколько сотен тысяч молекул тРНК, каждая из которых состоит всего из 70-90 нуклеотидов, свернутых в виде клеверного листа. На одном конце тРНК несут одну из двадцати аминокислот, которые служат строительными блоками белка, в то время как противоположный конец соединяется с кодоном, определяющим эту аминокислоту в матричной РНК во время трансляции. Хотя существует всего 61 кодон для двадцати аминокислот, клетки разных организмов могут содержать сотни уникальных молекул тРНК, некоторые из которых отличаются друг от друга только одним нуклеотидом.
Многие нуклеотиды в тРНК также украшены химическими модификациями, которые помогают тРНК складываться или связывать правильный кодон.
Уровни отдельных тРНК динамически регулируются в разных тканях и во время развития, а дефекты тРНК связаны с нейрогенными заболеваниями и раком. Молекулярное происхождение этих связей остается неясным, поскольку количественная оценка количества и модификаций тРНК в клетках долгое время оставалась сложной задачей. Команда Дэнни Недялковой из MPI биохимии разработала mim-tRNAseq, метод, который точно измеряет численность и статус модификации различных тРНК в клетках.
Блокировки и решения при изменении
Чтобы измерить уровни нескольких РНК одновременно, ученые используют фермент, называемый обратной транскриптазой, чтобы сначала переписать РНК в ДНК. Затем можно параллельно количественно оценить миллионы этих копий ДНК с помощью высокопроизводительного секвенирования.
Перезапись тРНК в ДНК была чрезвычайно сложной задачей, поскольку многие модификации тРНК блокируют обратную транскриптазу, заставляя ее прекращать синтез ДНК.
«Многие исследователи предложили элегантные решения этой проблемы, но все они снимают лишь часть препятствий на пути модификации тРНК», – объясняет Дэнни Недиалкова, руководитель исследовательской группы Макса Планка в Институте биохимии Макса Планка. «Мы заметили, что одна конкретная обратная транскриптаза, по-видимому, намного лучше считывает измененные сайты тРНК. Оптимизируя условия реакции, мы могли бы значительно повысить эффективность фермента, позволяя ему преодолевать почти все препятствия на пути модификации тРНК », – добавляет Недиалкова. Это позволило создать библиотеки ДНК из полноразмерных копий тРНК и использовать их для высокопроизводительного секвенирования.
Вычислительный инструментарий mim-tRNAseq
Анализ полученных данных секвенирования также представил серьезные проблемы. «Мы определили две основные проблемы: первая – это значительное сходство последовательностей между разными транскриптами тРНК», – объясняет Эндрю Беренс, аспирант в группе Недиалковой и первый автор статьи. "Вторая причина связана с тем, что неправильный нуклеотид (неправильное включение) вводится во многие модифицированные сайты во время обратной транскрипции. В обоих случаях чрезвычайно сложно сопоставить каждое считывание ДНК с молекулой тРНК, из которой она произошла ", – добавляет Беренс.
Команда решила эти проблемы с помощью новых вычислительных подходов, включая использование аннотации модификации для точного выравнивания чтения. Полученный комплексный инструментарий упакован в свободно доступный конвейер для выравнивания, анализа и визуализации данных секвенирования, полученных на основе тРНК . Исследователи могут использовать mim-tRNAseq не только для измерения количества тРНК, но также для картирования и количественной оценки модификаций тРНК, которые вызывают неправильное включение нуклеотидов с помощью обратной транскриптазы. «mim-tRNAseq открывает множество возможностей для продвижения вперед», – говорит Недялкова. «Мы надеемся, что это поможет нам и другим решить многие нерешенные вопросы о биологии тРНК в здоровье и болезнях."