Теперь это меняется.
В новом исследовании, проведенном Петрой Фромме и Надей Зацепин из Центра биодизайна для прикладных структурных открытий, Школы молекулярных наук и факультета физики АГУ, исследователи исследовали структуру Фотосистемы I (PSI) с помощью ультракоротких рентгеновских импульсов. в Европейском рентгеновском лазере на свободных электронах (EuXFEL), расположенном в Гамбурге, Германия.
PSI – это большая биомолекулярная система, которая действует как большой преобразователь солнечной энергии, преобразующий солнечную энергию в химическую энергию. Фотосинтез обеспечивает энергией всю сложную жизнь на Земле и поставляет кислород, которым мы дышим. Успехи в раскрытии секретов фотосинтеза обещают улучшить сельское хозяйство и помочь в разработке систем хранения солнечной энергии следующего поколения, которые сочетают в себе эффективность природы со стабильностью систем, спроектированных человеком.
«Эта работа настолько важна, поскольку она демонстрирует первое доказательство концепции мегагерцовой серийной кристаллографии с одним из самых крупных и сложных мембранных белков в фотосинтезе: Фотосистемой I», – говорит Фромме. «Эта работа прокладывает путь к исследованиям с временным разрешением на EuXFEL, чтобы определить молекулярные фильмы про управляемую светом траекторию электронов в фотосинтезе или визуализировать, как противораковые препараты атакуют неисправные белки."
EuXFEL, который недавно начал работу, является первым, в котором используется сверхпроводящий линейный ускоритель, который открывает новые захватывающие возможности, включая очень высокую частоту повторения его рентгеновских импульсов мегагерцового диапазона – более чем в 9000 раз быстрее, чем любой другой XFEL – с импульсами, разделенными на менее 1 миллионной секунды. С помощью этих невероятно коротких вспышек рентгеновского излучения исследователи смогут гораздо быстрее записывать молекулярные фильмы о фундаментальных биологических процессах и, вероятно, повлияют на различные области, включая медицину и фармакологию, химию, физику, материаловедение, исследования энергии, исследования окружающей среды, электроника, нанотехнологии и фотоника. Петра Фромме и Надя Зацепин – соавторы статьи, опубликованной в текущем номере журнала Nature Communications.
Сила в цифрах
Фромме является директором Центра биодизайна для прикладных структурных открытий (CASD) и руководит работой экспериментальной группы проекта, а Зацепин возглавляет группу анализа данных XFEL.
«Это важная веха в развитии серийной фемтосекундной кристаллографии, основанная на хорошо скоординированных усилиях большой междисциплинарной международной команды и многолетних разработках в разных областях», – подчеркивает Зацепин, бывший доцент-исследователь кафедры АГУ. Магистр физики и биодизайна CASD, а теперь старший научный сотрудник Университета Ла Троб в Австралии.
Кристофер Гизриэль, соавтор статьи, работал над проектом, будучи докторантом в лаборатории Фромма, и очень доволен этим проектом. "Быстрый сбор данных в последовательных экспериментах по фемтосекундной кристаллографии делает эту революционную методику более доступной для тех, кто интересуется взаимосвязью структура-функция для ферментов. Это подтверждается нашей новой публикацией в Nature Communications, в которой показано, что даже самые сложные и сложные белковые структуры могут быть решены с помощью последовательной фемтосекундной кристаллографии при сборе данных с частотой повторения мегагерц."
«Очень интересно наблюдать за тяжелой работой многих людей, которые привели к реализации этого проекта», – говорит Джесси Коу, соавтор, который в прошлом году закончил университет со степенью доктора философии.D. в биохимии от АГУ. "Это огромный шаг в правильном направлении к лучшему пониманию природного процесса переноса электронов, который совершенствовался на протяжении миллиардов лет. "
Экстремальная наука
XFEL (для рентгеновского лазера на свободных электронах) излучает рентгеновский свет, который в миллиард раз ярче, чем обычные источники рентгеновского излучения. Яркие, похожие на лазер рентгеновские импульсы производятся электронами, ускоренными почти до скорости света, и проходят через зазор между сериями чередующихся магнитов, устройство, известное как ондулятор.
Ондулятор заставляет электроны трястись и собираться в отдельные пакеты. Каждый из идеально синхронизированных движущихся электронных сгустков излучает мощный короткий рентгеновский импульс вдоль траектории полета электронов.
В последовательной фемтосекундной кристаллографии струя кристаллов белка вводится на путь импульсного луча XFEL при комнатной температуре, что дает структурную информацию в виде дифракционных картин. По этим паттернам ученые могут определять изображения белков в атомном масштабе в условиях, близких к естественным, что открывает путь к созданию точных молекулярных фильмов о работе молекул.
Рентгеновские лучи повреждают биомолекулы – проблема, которая десятилетиями преследовала попытки определения структуры, требуя замораживания биомолекул, чтобы ограничить ущерб. Но всплески рентгеновского излучения, производимые XFEL, настолько короткие – длятся всего фемтосекунды – что рассеяние рентгеновских лучей от молекулы может быть зарегистрировано до того, как произойдет разрушение, как при использовании быстрого затвора камеры. В качестве точки отсчета фемтосекунда – это одна миллионная миллиардной секунды, то же отношение, что и секунда, к 32 миллионам лет.
Из-за сложности, размера и стоимости установок XFEL в настоящее время во всем мире для таких экспериментов доступно только пять – серьезное узкое место для исследователей, поскольку каждый XFEL обычно может проводить только один эксперимент за раз.
Большинство XFEL генерируют импульсы рентгеновского излучения от 30 до 120 раз в секунду, и сбор данных, необходимых для определения одной структуры, не говоря уже о серии кадров в молекулярном фильме, может занять от нескольких часов до дней. EuXFEL – первый в своей конструкции сверхпроводящий линейный ускоритель, обеспечивающий самую быструю последовательность рентгеновских импульсов среди всех XFEL, что может значительно сократить время, необходимое для определения каждой структуры или кадра фильма.
Высокий риск, высокая награда
Поскольку образец уничтожается интенсивными импульсами рентгеновского излучения, он должен быть пополнен вовремя для следующего рентгеновского импульса, что потребовало, чтобы кристаллы PSI доставлялись в EuXFEL в 9000 раз быстрее, чем в более ранних XFEL – со скоростью струи. около 50 метров в секунду (160 футов в секунду), как микрофлюидный пожарный шланг. Это было непросто, поскольку требовалось большое количество драгоценного белка, содержащегося в однородных кристаллах, чтобы достичь таких высоких скоростей струи и избежать блокировки системы доставки образца.
Белки больших мембран настолько сложно выделить, кристаллизовать и доставить в пучок, что не было известно, можно ли изучать этот важный класс белков в EuXFEL.
Команда разработала новые методы, которые позволили PSI, который представляет собой большой комплекс, состоящий из 36 белков и 381 кофактора, который включает 288 хлорофиллов (зеленые пигменты, поглощающие свет) и имеет более 150000 атомов и более чем в 20 раз больше, чем изученные ранее белки. на EuXFEL, чтобы его структура была определена при комнатной температуре до замечательной 2.Разрешение 9 ангстрем – важная веха.
Для нового исследования пришлось выращивать миллиарды микрокристаллов мембранного белка PSI, полученных из цианобактерий.
Требовался быстрый рост кристаллов из зародышей нанокристаллов, чтобы гарантировать существенную однородность размера и формы кристаллов. PSI – это мембранный белок, который представляет собой класс очень важных белков, которые, как известно, сложно охарактеризовать. Их сложные структуры встроены в липидный бислой клеточной мембраны.
Как правило, они должны быть тщательно изолированы в полностью активной форме от их естественной среды и преобразованы в кристаллическое состояние, в котором молекулы упаковываются в кристаллы, но сохраняют все свои естественные функции.
В случае PSI это достигается путем его экстракции очень мягкими детергентами, которые заменяют мембрану и окружают белок, как внутреннюю трубку бассейна, которая имитирует естественную мембранную среду и сохраняет полную функциональность PSI, когда она упакована в кристаллы.
Поэтому, когда исследователи направляют свет на зеленые пигменты (хлорофиллы), которые улавливают свет антенной системой PSI, энергия используется для того, чтобы стрелять электроном через мембрану.
Чтобы PSI оставалась полностью работоспособной, кристаллы имеют лишь слабую упаковку, содержащую 78% воды, что делает их мягкими, как кусок масла на солнце, и затрудняет обращение с этими хрупкими кристаллами . «Выделить, охарактеризовать и кристаллизовать один грамм PSI или один миллиард миллиардов PSI молекул, поскольку эксперименты в их полностью активной форме были огромными усилиями студентов и исследователей в моей команде», – говорит Фромме.«В будущем, с еще более высокой частотой повторения и новыми системами доставки образцов, потребление образцов будет значительно снижено."
Еще одной проблемой были запись и анализ дифракционных данных.
Уникальный детектор рентгеновского излучения был разработан EuXFEL и DESY для удовлетворения требований структурно-биологических исследований в EuXFEL: пиксельный детектор с адаптивным усилением, или AGIPD. Каждый из 1 миллиона пикселей AGIPD составляет менее одной сотой дюйма в поперечнике и содержит 352 аналоговых ячейки памяти, которые позволяют AGIPD собирать данные с мегагерцовой частотой в большом динамическом диапазоне. Однако для сбора точных кристаллографических данных с микрокристаллов больших мембранных белков требовался компромисс между пространственным разрешением и выборкой данных.
«Стремление к сбору данных с более высоким разрешением при текущем размере детектора может помешать полезной обработке кристаллографических данных, потому что дифракционные пятна недостаточно разрешены пикселями рентгеновского детектора», – предупреждает Зацепин, «но с точки зрения скорости передачи данных и динамического диапазона, что AGIPD способен невероятно."
Новое программное обеспечение для обработки данных и кристаллографического анализа, разработанное специально для решения задач, уникальных для массивных наборов данных в кристаллографии XFEL, разработкой которой руководили сотрудники CFEL, DESY и ASU, прошло долгий путь с момента появления первого XFEL с высоким разрешением. эксперимент 2011 года.
«Наше программное обеспечение и высокопроизводительные вычислительные возможности DESY действительно подвергаются испытанию с беспрецедентными объемами данных, созданными на EuXFEL. Всегда интересно раздвигать границы современных технологий », – добавляет Зацепин.
Мембранные белки: гибкие, но грозные
Мембранные белки, такие как PSI, названные так, потому что они встроены в клеточные мембраны, жизненно важны для всех жизненных процессов, включая дыхание, нервную функцию, потребление пищи и передачу сигналов между клетками. Поскольку они находятся на поверхности каждой клетки, они также являются наиболее важными мишенями для фармацевтических препаратов. Более 60% всех современных лекарств нацелены на мембранные белки. Следовательно, разработка более эффективных лекарств с меньшим количеством побочных эффектов зависит от понимания того, как конкретные лекарства связываются со своими целевыми белками, а также от их высокодетальных структурных конформаций и динамической активности.
Несмотря на их огромное значение в биологии, мембранные белковые структуры составляют менее 1% всех белковых структур, решенных на сегодняшний день, потому что их, как известно, сложно выделить, охарактеризовать и кристаллизовать. Вот почему крупные достижения в области кристаллографических методов, такие как появление мегагерцовой серийной фемтосекундной кристаллографии мембранных белков, несомненно, окажут значительное влияние на научное сообщество.
Требуется деревня
Эти недавние достижения были бы невозможны без неустанных усилий специальной группы из почти 80 исследователей из 15 институтов, включая ASU, European XFEL, DESY, Центр сверхбыстрых рентгеновских исследований, Институт Хауптмана-Вудворда, SUNY Buffalo, SLAC. , Гамбургский университет, Геттингенский университет, Венгерская академия наук, Университет Теннесси, Ливерморская национальная лаборатория Лоуренса, Саутгемптонский университет, Гамбургский технологический университет, Висконсинский университет. В исследовательскую группу вошли сотрудники из США из Научно-технологического центра NSF BioXFEL и группа международных сотрудников, в том числе Адриан П. Манкузо и Ромен Летрун, ведущие ученые на канале EuXFEL, а также Александр Ефанов и Антон Барти из CFEL / DESY, которые работали в тесном сотрудничестве с командой ASU над комплексным анализом данных.