В настоящее время наличие четырех основных видов Plasmodium, вызывающих малярию, P. falciparum, P. vivax, P. ovale и P. malariae определяется с помощью микроскопического анализа образцов крови, в которых паразиты могут быть обнаружены в красных кровяных тельцах, или с помощью так называемых экспресс-тестов на специфические белки (антигены) Plasmodium.
«К сожалению, доступные методы быстрой диагностики не могут отличить все четыре вида Plasmodium друг от друга, что может быть важно для начала окончательного курса лечения, и, что наиболее важно, они неэффективны для обнаружения небольшого количества паразитов Plasmodium у бессимптомных людей», – сказал он.
Нира Поллок, M.D., Ph.D., Заместитель медицинского директора лаборатории диагностики инфекционных заболеваний Бостонской детской больницы и доцент кафедры патологии и медицины Гарвардской медицинской школы. «Эти« бессимптомные носители »являются тихими резервуарами для продолжающейся передачи малярийными комарами и чрезвычайно важны для продолжающихся глобальных усилий по искоренению малярии», – добавил Джеффри Дворин, M.D., Ph.D., Адъюнкт-профессор педиатрии Гарвардской медицинской школы и старший младший врач по инфекционным заболеваниям в Бостонской детской больнице.
Теперь, междисциплинарное исследовательское сотрудничество, которое возглавил член факультета Wyss Core Джеймс Коллинз, доктор философии.D. в Гарвардском институте биологической инженерии Висса и Массачусетском технологическом институте (MIT), собранные клиническим научным сотрудником Rose Lee, M.D., MSPH, в которую также входили Поллок и Дворин, создал применимый в полевых условиях сверхчувствительный диагностический тест, который специфически выявляет последовательности ДНК от всех видов Plasmodium при симптоматической и бессимптомной малярии.
Новый метод диагностики малярии сочетает в себе оптимизированный 10-минутный протокол быстрой подготовки образцов с системой SHERLOCK на основе CRISPR, чтобы обеспечить высокоспецифичное и чувствительное обнаружение плазмодиев еще за 60 минут с помощью простых репортерных устройств. Он опубликован в PNAS.
«Этот готовый к эксплуатации диагностический тест на малярию SHERLOCK превосходит требования к чувствительности и специфичности, установленные ВОЗ для желаемого теста, который может использоваться для выявления низкой плотности паразитов у бессимптомных носителей всех основных видов плазмодиев», – сказал член факультета-основателя Wyss Джеймс Коллинз. , Доктор философии.D. "Его очень оптимизированная конструкция могла бы обеспечить жизнеспособное решение существующего диагностического узкого места на пути к ликвидации малярии и, в более общем плане, обеспечить возможность эпиднадзора за малярией в условиях ограниченных ресурсов."Коллинз – руководитель направления Института по живым клеточным устройствам, а также профессор медицинской инженерии и науки в Массачусетском технологическом институте.
Исследовательская группа продемонстрировала свой разработанный метод SHERLOCK (сокращение от Specific High-Sensitive Enzymatic Reporter unLOCKing), способный обнаруживать менее двух паразитов на микролитр крови, предлагаемый ВОЗ «предел обнаружения» (LOD) для теста с широким применением. в эндемичных районах. Показ клинического потенциала анализа путем анализа клинических образцов, содержащих P. falciparum и P. vivax, они выявляли их со 100% чувствительностью, правильно идентифицируя истинно положительные образцы, и 100% специфичностью, также правильно определяя образцы, в которых отсутствуют определенные виды Plasmodium, в истинно отрицательных образцах. Чувствительность и специфичность, близкие к 100%, являются ключевыми характеристиками диагностических тестов, используемых в реальных тестах.
Более того, анализ разработан таким образом, что он также может определять присутствие часто мутировавшего P. falciparum, которые утратили свой антиген HRP2 и, таким образом, ускользают от обнаружения с помощью обычных экспресс-диагностических тестов.
Группа Коллинза из Института Висса и Массачусетского технологического института совместно разработали технологию SHERLOCK с группой Фэн Чжана из Института Броуда.
Он был лицензирован для Sherlock Biosciences, стартапа, который использовал его для создания быстрой молекулярной диагностики других заболеваний, а недавно получил разрешение FDA на экстренное использование для своей быстрой диагностики COVID-19.
Были разработаны другие методы, которые, как и новый анализ SHERLOCK, амплифицируют и обнаруживают материал нуклеиновых кислот ДНК (или РНК) видов Plasmodium. Однако на сегодняшний день эти методы остаются ограниченными из-за необходимости в дорогостоящем лабораторном оборудовании, как в случае методов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), сложных методик подготовки проб и обученного персонала или, как в случае более простого «изотермического» метода. "методы усиления, выполненные при одной температуре, они не показали желаемой чувствительности в полевых условиях.
Анализ малярии SHERLOCK использует фермент CRISPR-Cas12a, который может быть запрограммирован на активацию так называемой направляющей РНК, которая связывается с конкретной целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, в данном случае последовательностью одного из четырех видов Plasmodium.
Активированный Cas12a затем неспецифически расщепляет любую однонитевую цепь ДНК в непосредственной близости от нее с чрезвычайно высокой скоростью оборота около 1250 реакций коллатерального расщепления в секунду. Исследователи использовали эту усиливающую активность в своем анализе, интегрировав ее с оптимизированной пробоподготовкой, которая не требует определенного этапа экстракции нуклеиновых кислот, как некоторые другие тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT), и изотермической амплификации конкретных последовательностей ДНК и РНК плазмодия в внешний интерфейс. Направляющие РНК, которые распознают видоспецифические мотивы в амплифицированных последовательностях плазмодия, затем высвобождают активность Cas12a, которая сопутствующим образом атакует репортерные последовательности одноцепочечной ДНК, продукты расщепления которых помогают сигнализировать о присутствии патоген-специфичных нуклеиновых кислот. В конце анализа сигнал создается, чтобы либо вызвать изменение флуоресценции в портативном устройстве, либо конкретную полосу на полосе бокового потока, обычно используемую в клинических устройствах для оказания медицинской помощи.
«Важно отметить, что анализ совместим с различными типами образцов, такими как цельная кровь, плазма, сыворотка и высушенная кровь, и все компоненты, необходимые для амплификации, активации Cas12a и генерации сигнала, могут быть лиофилизованы в одной пробирке для совместной работы в одной пробирке. «реакция в одном горшке после того, как они воссозданы и смешаны с образцом пациента», – сказала первый автор Роуз Ли, научный сотрудник группы Коллинза и Бостонской детской больницы с большим интересом к диагностике инфекционных заболеваний и сыграла важную роль в сборке мульти- дисциплинарная команда вместе с Коллинзом. "Это позволяет избежать зависимости от функциональной холодовой цепи и позволяет проводить тестирование в условиях ограниченных ресурсов с минимальным опытом."
«Молекулярный анализ для диагностики малярии, созданный в рамках сотрудничества, указывает на то, как возможности Института Висса в области синтетической биологии в сочетании с опытом в области биологии и эпидемиологии инфекционных заболеваний могут изменить течение действительно изнурительных заболеваний, парализующих большие группы населения во всем мире», – сказал он. сказал директор-основатель Wyss Institute Дон Ингбер, M.D., Ph.D., который также является профессором биологии сосудов Гарвардской медицинской школы и Бостонской детской больницы Джуды Фолкмана и профессором биоинженерии в Гарварде Джон А. Школа инженерии и прикладных наук Полсона.