Генетические переключатели – это регуляторные сети генов, которые контролируют экспрессию генов. Исследователи создали платформу для создания генетических переключателей, которые могут быть применены для разработки сложных, искусственно контролируемых дрожжевых клеток для производства больших количеств ценных соединений. Эти результаты исследования были опубликованы в журнале Nature Communications 23 марта 2021 г.
* 1 исследователь Ассоциации технологических исследований высокоэффективного дизайна генов (TRAHED).
* 2 Там же. Заместитель директора Центра Кобе.
* 3 Там же. Директор центра Кобе.
Основные моменты
Генетические переключатели необходимы для искусственного создания новых функций в организме.
Эти переключатели контролируют количество белков, производимых геном (i.е. экспрессия гена (* 1)) и время этого производства.
Имело место отставание в разработке генетических переключателей, в частности, для эукариотических организмов, а также значительное ограничение на количество генов, которые можно контролировать одновременно.
Исследователи разработали новую платформу отбора, в которой можно установить порог отсечения.
Это позволило им добиться успеха в создании высокофункциональных искусственных генетических переключателей для дрожжей, которые можно производить легко и гибко.
Ожидается, что разработанная платформа найдет широкий спектр приложений в ситуациях, требующих точного контроля уровней экспрессии и времени для большого количества генов. Это включает оптимизацию баланса экспрессии метаболических ферментов при построении клеток для производства полезных веществ, которые имеют сложный внутриклеточный метаболизм.
Предпосылки исследования
Количество и тип генов, которыми обладает организм, не только определяют его жизненные функции. Время и количество белков, продуцируемых геном (i.е. экспрессия гена) – это другие факторы, которые, как известно, приводят к значительным изменениям. В области синтетической биологии недавние достижения позволили создать множество новых функций клетки путем искусственного контроля экспрессии определенных генов.
Генетические переключатели необходимы для контроля скорости и времени экспрессии генов. Генетический переключатель (рисунок 1) – это регуляторная система, которая включает или выключает экспрессию определенного гена в ответ на стимул (или индуктор) изнутри или снаружи клетки (например, присутствие химическое вещество). Следовательно, генетические переключатели являются важным инструментом синтетической биологии, целью которой является искусственное проектирование и построение клеточных функций.
Многие генетические переключатели были разработаны для простых одноклеточных организмов (прокариот), таких как E. кишечная палочка.
Однако системы экспрессии генов у эукариотических организмов, таких как люди, растения и дрожжи, более сложны. Следовательно, у этих организмов наблюдается отставание в развитии генетических переключателей.
Несмотря на то, что дрожжи являются модельным эукариотическим организмом, попытки сконструировать функции их клеток натолкнулись на большие ограничения.
Методология исследования
При конструировании генетических переключателей очень сложно предсказать, где и как изменять переключатели, чтобы можно было контролировать экспрессию генов. Эволюционная молекулярная инженерия – полезный метод для определения этого (рис.
2). Метод включает создание библиотеки вариантов генетического переключателя путем случайного индуцирования мутации (* 2) в части или во всем генетическом переключателе, а затем выбор вариантов, которые демонстрируют предполагаемую производительность.
Хотя легко создать большое количество вариантов, желаемые варианты в этом количестве должны быть быстро идентифицированы. Был проведен искусственный процесс исключения (отбора) для отбора клеток, оставшихся как при «выключенной» экспрессии гена, так и при «включении» экспрессии гена определенным индуктором. Однако, если выбор слишком сильный или слишком слабый, невозможно выделить лучшие варианты.
Хотя необходимо выбрать функциональные варианты генетического переключателя, которые достаточно устойчивы как в состоянии «включено», так и в состоянии «выключено», очень трудно предсказать, насколько сильным должен быть выбор заранее.
Команда исследователей из Университета Кобе и Университета Чиба создала систему рабочего процесса, с помощью которой они могли параллельно генерировать выборки различной силы, изменяя тип или концентрацию химических веществ, используемых для выбора. После выбора группы вариантов исследователи подвергли каждый из них внешнему стимулу (индуктору) и проанализировали степень, в которой это включило экспрессию генов, наблюдая за изменением уровня света, излучаемого GFP (зеленые флуоресцентные белки).
Это позволило им определить наиболее подходящий отбор, другими словами, легко идентифицировать варианты генетического переключателя, которые продемонстрировали высокий уровень производительности. Используя этот метод, исследователи успешно разработали три новых генетических переключателя, которые были столь же эффективны, как и наиболее эффективный переключатель, разработанный для дрожжей до сих пор.
Объединив эти три генетических переключателя, исследователи получили дрожжи, которые могут биосинтезировать оранжевый пигмент (?-каротин) под И-контролем (i.е. куда ?-каротин мог быть произведен только в том случае, если присутствовали два конкретных химических соединения, DAPG и HSL).
Дальнейшие разработки
Метод отбора, разработанный этой исследовательской группой, ускорит разработку широкого спектра генетических переключателей для дрожжей с различными уровнями производительности и характеристиками. Это также приведет к быстрому увеличению количества генов, которыми можно управлять параллельно. Объединение этих новых генетических переключателей позволит искусственно создать клеточные функции.
Например, это может способствовать развитию сложных, искусственно регулируемых дрожжевых клеток для производства больших количеств полезных органических соединений.
Глоссарий
1. Экспрессия генов: гены кодируют белки и состоят из 4 типов оснований: A, T, G и C. Белки производятся в соответствии с расположением этих оснований. Этот процесс называется экспрессией гена.
2. Мутация: изменение типа оснований, составляющих ген. Мутации изменяют инструкции по производству белков и могут привести к изменению функции белков.