Биологам удалось определить структуру многих из этих комплексов, но пока мало исследований того, как отдельные белки собираются, а затем изменяются с течением времени. Традиционных подходов до сих пор оказалось недостаточно для изучения точного хода этих реакций в клетках, особенно когда речь идет о больших комплексах.
Группа исследователей ETH под руководством Карстена Вайса и научного сотрудника Евгения Онищенко из Института биохимии ETH Zurich теперь представляет новый подход. Их метод позволяет отслеживать динамику сборок белковых комплексов, даже для очень больших, с высоким временным разрешением. Исследование только что опубликовано в журнале Cell.
На основе метаболического анализа
Исследователи ETH называют свой новый подход KARMA, который означает кинетический анализ скорости включения в макромолекулярные сборки и основан на методах исследования метаболических процессов. Ученые, изучающие метаболизм, давно использовали радиоактивный углерод в своей работе.грамм., для маркировки молекул глюкозы, которые клетки затем усваивают и метаболизируют. Радиоактивная маркировка позволяет исследователям отслеживать, где и в какой момент времени появляются молекулы глюкозы или их метаболиты.
«Этот тип исследования вдохновил нас на применение аналогичного принципа при изучении реакций, происходящих при сборке белковых комплексов», – объясняет Вайс.
В своем подходе исследователи ETH работают с мечеными аминокислотами, основными строительными блоками белков, которые содержат более тяжелые изотопы углерода и азота. В культуре дрожжевых клеток команда заменяет легкие аминокислоты на их более тяжелые аналоги. Дрожжи используют эти тяжелые аминокислоты в синтезе белка, что приводит к сдвигу молекулярной массы всех вновь продуцируемых белков.
Шкала времени сборки комплекса
Чтобы выделить белковые комплексы, исследователи удаляют дрожжевые клетки из культур через регулярные промежутки времени и используют масс-спектрометрию для измерения крошечной разницы в весе между молекулами с более тяжелыми аминокислотами и молекулами без них.
Это указывает на возраст белка в комплексе. В основном, чем старше белок, тем раньше он был включен в комплекс. Основываясь на этих возрастных различиях, исследователи применяют модели кинетического состояния, чтобы в конечном итоге восстановить точную последовательность сборки данного белкового комплекса.
В качестве примера для проверки своего метода Вейс и его команда выбрали комплекс ядерных пор в дрожжевых клетках. Эта структура содержит от 500 до 1000 элементов, состоящих из примерно 30 различных белков, каждый в нескольких копиях, что делает ее одним из крупнейших известных белковых комплексов.
Используя KARMA, биохимики ETH смогли получить подробную карту того, какие модули интегрированы в структуру и когда.
Одним из открытий был принцип иерархии: отдельные белки за очень короткое время образуют субъединицы, которые затем собираются от центра к периферии в определенной последовательности.
Прочные подмости
«Мы впервые продемонстрировали, что некоторые белки очень быстро используются в сборке порового комплекса, в то время как другие включаются только примерно через час. Это невероятно долгий срок », – говорит Вайс.
Клетка дрожжей делится каждые 90 минут, а это значит, что потребуется почти целое поколение, чтобы завершить сборку этого жизненно важного комплекса пор. Неизвестно, почему формирование новых пор занимает так много времени по сравнению с циклом размножения дрожжей.
Исследователи ETH также показывают, что после завершения сборки поры части комплекса становятся очень стабильными и долговечными – например, во внутреннем каркасе почти не заменяются какие-либо компоненты в течение его срока службы. Напротив, белки на периферии комплекса ядерных пор часто заменяются.
Дефектные ядерные поры способствуют развитию болезни
Ядерные поры являются одними из наиболее важных белковых комплексов в клетках, поскольку они отвечают за обмен веществ и молекул между ядром клетки и цитоплазмой.
Например, они транспортируют РНК-мессенджер из ядра в клеточный аппарат вне ядра, которому эти молекулы нужны в качестве чертежей для новых белков.
Более того, ядерные поры играют прямую и косвенную роль в заболеваниях человека. Соответственно, изменения в ядерной поре и ее белках могут влиять на развитие таких состояний, как лейкемия, диабет или нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера. «В целом, однако, причины, по которым дефекты пор вызывают эти паттерны болезней, не совсем понятны», – говорит Вайс, поясняя, что KARMA может помочь в более глубоком понимании таких проблем в будущем.
Универсальная платформа
«Хотя в этом исследовании мы применили KARMA только к одному белковому комплексу, мы с нетерпением ждем его будущих приложений.
Наш метод теперь позволит нам расшифровать последовательность целого ряда биологических процессов », – говорит Вайс. Их метод может быть использован, например, для изучения молекулярных событий, которые происходят во время цикла заражения вирусами, такими как COVID-19, и потенциально может помочь найти новые лекарственные препараты-кандидаты, которые разорвут этот цикл.
Новый метод также может быть применен к другим биологическим молекулам помимо белков, таким как РНК или липиды.