Исследователи использовали новый высокопроизводительный метод измерения скорости, с которой бактерии обмениваются пакетами ДНК, которые придают устойчивость. Скорость и возможность автоматизации большей части процесса могут позволить по-новому взглянуть на то, какие переменные влияют на скорость передачи. Такие усилия могут помочь врачам замедлить или даже обратить вспять распространение резистентности некоторых патогенов человека.
Результаты будут опубликованы 24 января в журнале Science Advances.
«Наше предыдущее исследование показало, что антибиотики не влияют на скорость, с которой бактерии распространяют свою резистентность непосредственно среди своего сообщества в лабораторных штаммах E.coli, – сказал Линчонг Ю, профессор биомедицинской инженерии в Duke. "Но мы хотели проверить, верно ли это и для клинических штаммов патогенов, которые действительно существуют в мире."
Каждый устойчивый к антибиотикам патоген несет генетический рецепт устойчивости. Но, как и печенье с шоколадной крошкой, не все рецепты одинаковы, и не все из них легко можно научить другим.
Однако один из способов передачи устойчивости состоит в том, чтобы этот генетический рецепт был аккуратно записан в своего рода общедоступную книгу, называемую плазмидой, которая затем подбирается и считывается соседними бактериями посредством процесса, называемого конъюгацией.
По мере роста устойчивости к антибиотикам во всем мире ученые пытаются выяснить, как остановить ее распространение.
Но поскольку многие антибиотики поступают из естественных источников, невозможно полностью устранить резистентность в дикой природе, а это означает, что всегда будут резервуары бактерий, заполненные книгами рецептов для резистентности.
«Итак, настоящая проблема заключается в том, что резистентность проникает в патогены, которые вредят людям», – сказал Джонатан Бетке, аспирант, работающий в лаборатории Ю и первый автор новой статьи. "Мы стремимся получить хорошее представление о том, какие факторы влияют на скорость их конъюгации, потому что, если вы сможете достаточно замедлить этот процесс, плазмиды, несущие гены устойчивости, могут выпасть из популяции."
Однако одной из основных проблем в достижении этого является классический метод измерения скорости конъюгации плазмид.
Помимо трудоемкости, исследователи должны ждать 16 часов, пока новое поколение бактерий не вырастет в чашках Петри, прежде чем они смогут получить результаты. Это ограничение затрудняет использование этого подхода при работе с сотнями бактериальных штаммов и десятками настраиваемых переменных.
Вместо того, чтобы тратить годы на завершение эксперимента, Бетке и Эллисон Лопаткин, бывшая аспирантка лаборатории Ю, которая сейчас работает доцентом в Барнард-колледже, разработали метод, который использует автоматизированное оборудование и требует всего пять часов для получения результатов. Он включает в себя смешивание двух штаммов бактерий – донорского штамма с устойчивостью к одному антибиотику, который может быть передан посредством конъюгации плазмиды, и штамма-реципиента с устойчивостью к другому антибиотику, который нельзя разделить.
После того, как штаммы смешались и процесс конъюгации плазмид произошел в течение определенного периода времени, бактериальная смесь переносится во флаконы, содержащие питательные вещества и оба антибиотика. Это способствует росту бактерий-реципиентов, которые успешно получили плазмиды донора для обеспечения устойчивости, в то же время останавливая рост всех остальных. Затем исследователи ждут, чтобы увидеть, сколько времени потребуется новой популяции с двойной устойчивостью, чтобы достичь определенного порога, который указывает, сколько их было вначале.
«Этот метод открывает возможность тестировать гораздо больше лекарств или факторов окружающей среды, чтобы увидеть, как они влияют на скорость конъюгации плазмид», – сказал Бетке. "Это также позволит нам определить, есть ли какой-то генетический детерминант, который играет большую роль с точки зрения скорости передачи."
Вы и Бетке в сотрудничестве с Джошуа Таденом, доцентом медицины в Duke, и Вэнсом Фаулером, профессором медицины в Duke, получили 219 клинических изолятов патогенов – ошибок, обнаруженных у реальных пациентов. Все они обладают устойчивостью к бета-лактамазе, наиболее распространенной форме антибиотиков, используемых сегодня.
Измеряя скорость конъюгации плазмид как с присутствующими бета-лактамазными антибиотиками, так и без них, они показали, что, за исключением одного выброса, эти антибиотики не увеличивают скорость обмена резистентностью. Они также обнаружили, что более 25 процентов изученных штаммов способны делиться своей устойчивостью со скоростью, достаточно быстрой для обнаружения.
«Мы были удивлены, обнаружив, что это было так высоко», – сказал Ю. «И, конечно же, антибиотики способствуют распространению резистентности, но наше исследование показывает, что это происходит в первую очередь за счет селективной динамики популяции, а не за счет увеличения скорости конъюгации плазмид."
Исследователи также изучили, как небольшие вариации генетики самих плазмид устойчивости влияют на скорость их конъюгации.
Работая с лабораторией Минфэн Сяо в BGI Genomics в Шэньчжэне, Китай, команда секвенировала плазмиды и проанализировала их ДНК. Затем они разделили плазмиды на «группы мобильности» в зависимости от того, как они прыгают между клетками, и «группы несовместимости» в зависимости от того, как они реплицируются.
К большому удивлению исследователей, они обнаружили, что хотя в их библиотеке образцов присутствовали только две группы мобильности, ни одна из которых не влияла на скорость конъюгации, было семь групп несовместимости – и они очень сильно влияли на скорость конъюгации.
«Это предварительное, но потенциально большое открытие, потому что эти две классификации являются генетическими, что позволяет легко их идентифицировать», – сказала Бетке. "Если мы сможем начать создавать библиотеку генетических маркеров, которые указывают, какой вероятной будет способность патогена распространять свою резистентность непосредственно на своих соседей, тогда мы сможем начать делать большие прогнозы о таких вещах, как сети горизонтального переноса генов, и, возможно, начнем понимать как бактерии развиваются в результате этого процесса в целом."
«Такая библиотека также будет иметь прямое отношение к тому, как врачи используют антибиотики в полевых условиях», – сказал Ю. "Эти знания помогут врачам принимать индивидуальные решения о назначении антибиотиков пациентам."